English
  • page_banner

Aħbarijiet

Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Iċ-ċelloli tal-kanċer evolvew diversi mekkaniżmi biex jegħlbu l-istress ċellulari u jkomplu javvanzaw.Protein kinase R (PKR) u l-attivatur tal-proteina tiegħu (PACT) huma r-rispons inizjali li jimmonitorjaw diversi sinjali ta 'stress li jwasslu għall-inibizzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli u l-apoptożi.Madankollu, ir-regolamentazzjoni tal-mogħdija PACT-PKR fiċ-ċelloli tal-kanċer għadha fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa.Hawnhekk, sibna li RNA twil mhux kodifikanti (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) huwa direttament involut fl-inibizzjoni tal-mogħdija PACT-PKR u jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer.Bl-użu ta 'screening funzjonali fuq skala kbira ta' lncRNA assoċjat mal-kanċer CRISPRi 971, sibna li DARS-AS1 kien assoċjat ma 'proliferazzjoni mtejba b'mod sinifikanti taċ-ċelluli tal-kanċer.Għalhekk, DARS-AS1 knockout jinibixxi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli u jippromwovi l-apoptosi taċ-ċelluli tal-kanċer f'diversi linji taċ-ċelluli tal-kanċer in vitro u jnaqqas b'mod sinifikanti t-tkabbir tat-tumur in vivo.Mekkanikament, DARS-AS1 jorbot direttament mad-dominju ta 'attivazzjoni PACT u jipprevjeni l-interazzjoni PACT-PKR, u b'hekk inaqqas l-attivazzjoni ta' PKR, fosforilazzjoni eIF2α, u jinibixxi l-mewt taċ-ċelluli apoptotiċi.Klinikament, DARS-AS1 huwa espress b'mod wiesa 'f'kanċer multipli, u l-espressjoni żejda ta' dan l-lncRNA hija indikattiva ta 'pronjosi ħażina.Dan l-istudju jiċċara r-regolamentazzjoni speċifika għall-kanċer tal-mogħdija PACT-PKR minn DARS-AS1 lncRNA u jipprovdi mira oħra għall-pronjosi u t-trattament tal-kanċer.
Il-kapaċità li jadattaw għall-istress hija karatteristika importanti tas-sopravivenza u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer.Il-proliferazzjoni mgħaġġla u l-karatteristiċi metaboliċi tal-kanċer jilħqu l-ogħla livell f'mikroambjenti ħarxa—deprivazzjoni tan-nutrijenti, ipoksja, u pH baxx—li jistgħu jikkawżaw mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni tal-mewt taċ-ċelluli.Disregolazzjoni ta 'ġeni sensittivi għall-istress bħal p535, proteini ta' xokk tas-sħana 6, 7, KRAS8, 9, u HIF-110, 11, 12, 13 hija osservata ta 'spiss fil-kanċer, u b'hekk timblokka l-apoptożi u tippromwovi s-sopravivenza.
Protein kinase R (PKR) huwa sensor ta 'stress importanti u subunit kinase ta' fattur ta 'bidu ewkarjotiku 2α (eIF2α), regolatur tat-traduzzjoni li jgħaqqad l-istress ċellulari mal-mewt taċ-ċelluli.PKR kien oriġinarjament identifikat bħala proteina antivirali mill-iskoperta ta 'RNA double-stranded barrani (dsRNA).Mal-attivazzjoni, PKR fosforila eIF2α biex jinibixxi s-sinteżi tal-proteini virali u ċellulari14,15,16.PACT (proteina attivatur PKR) ġiet identifikata bħala l-ewwel proteina attivatur PKR fin-nuqqas ta 'dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Permezz ta 'interazzjoni diretta ma' PKR, PACT jittrasduce diversi stress (ġuħ fis-serum, trattament ta 'perossidu jew arsenite) għal PKR u mogħdijiet ta' sinjalazzjoni 'l isfel.Minbarra l-fosforilazzjoni ta 'eIF2α, l-attivazzjoni PKR medjata mill-PACT tqanqal diversi avvenimenti assoċjati mar-rispons għall-istress, inkluż status redox mibdul permezz tal-mogħdija PI3K/Akt24, verifika mtejba tal-ħsara fid-DNA permezz ta' p5325,26 u NF-κB27,28 Jirregola t-traskrizzjoni, 29. Minħabba r-rwol kritiku tagħhom fir-rispons għall-istress, il-proliferazzjoni, l-apoptożi u proċessi ċellulari ewlenin oħra, PKR u PACT huma miri terapewtiċi promettenti għal ħafna mard, speċjalment il-kanċer30,31,32,33.Madankollu, minkejja din is-sinifikat funzjonali u bijoloġiku plejotropiku, ir-regolamentazzjoni tal-attività PACT/PKR fiċ-ċelloli tal-kanċer tibqa' elużiva.
LncRNAs huma traskrizzjonijiet akbar minn 200 nukleotide mingħajr potenzjal ta 'kodifikazzjoni ta' proteini.Peress li proġetti ta’ sekwenzar tal-ġenoma sħaħ avvanzati identifikaw eluf ta’ lncRNAs,35,36 sar ħafna sforz biex jiġu spjegati l-funzjonijiet bijoloġiċi tagħhom.Korp dejjem jikber ta 'riċerka wriet li lncRNAs huma involuti f'ħafna proċessi bijoloġiċi37 inkluż ir-regolamentazzjoni ta' inattivazzjoni tal-kromożomi X38,39, imprinting40, traskrizzjoni41,42, traduzzjoni43 u anke tkabbir tal-kanċer44,45,46,47.Dawn l-istudji rrappurtaw li ħafna lncRNAs huma involuti fil-mogħdija PACT/PKR.Studju wieħed bħal dan wera li lncRNA ASPACT inibixxa t-traskrizzjoni PACT u żied iż-żamma nukleari tal-mRNA PACT.Studji oħra wrew li lncRNA nc886 jeħel mal-PKR u jinibixxi l-fosforilazzjoni tiegħu49,50.S'issa, lncRNA li jirregola l-attivazzjoni PKR medjata mill-PACT ma ġietx irrappurtata.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ġie identifikat bħala lncRNA51,52,53,54 onkoġeniku.Permezz tar-regolamentazzjoni ta 'miP-194-5p53, miP-12952 u miP-532-3p51, DARS-AS1 intwera li jippromwovi t-tkabbir ta' karċinoma taċ-ċelluli renali taċ-ċelluli ċari, karċinoma tat-tirojde u karċinoma tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar, rispettivament.Tong u l-kollegi sabu wkoll li DARS-AS1 jippromwovi l-progressjoni tal-majeloma billi jżommu l-istabbiltà tal-motif li jgħaqqad l-RNA tal-proteina 39 (RBM39).Madankollu, ma sarux studji dwar jekk dan l-lncRNA huwiex involut fir-regolamentazzjoni tal-attivazzjoni tal-PACT-PKR u r-rispons għall-istress taċ-ċelloli tal-kanċer.
Hawnhekk, wettaqna skrin ta 'telf ta' funzjoni fuq skala kbira bl-użu tas-sistema CRISPRi u ddeterminajna li DARS-AS1 lncRNA jippromwovi l-proliferazzjoni ta 'diversi tipi ta' ċelluli tal-kanċer.Barra minn hekk, identifikajna mekkaniżmu ewlieni: DARS-AS1 jeħel direttament ma 'PACT, jinibixxi l-irbit ta' PACT u PKR, jipprevjeni l-fosforilazzjoni ta 'eIF2α, sottostrat PKR aktar baxx, u fl-aħħar jinibixxi l-mewt taċ-ċelluli apoptotiċi.Bħala konklużjoni, ix-xogħol tagħna jiżvela l-lncRNA DARS-AS1 bħala regolatur tal-mogħdija PACT-PKR u mira potenzjali għat-trattament u l-pronjosi tal-kanċer.
Studji estensivi ta 'profiling ġenomika identifikaw mijiet ta' lncRNAs assoċjati mal-kanċer.Madankollu, il-funzjoni tagħhom għadha fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa56.Biex nidentifikaw kandidati promettenti tal-lncRNA involuti fil-progressjoni tal-kanċer, wettaqna skrin ta 'telf ta' funzjoni għal proliferazzjoni mnaqqsa fil-linja taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum SW620 bl-użu tas-sistema CRISPRi (Fig. 1a).Il-karatteristika unika tal-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolon SW480 u SW620 hija li huma derivati ​​minn tumuri primarji u sekondarji f'pazjent wieħed.Dan jipprovdi paragun siewi għall-istudju tal-bidliet ġenetiċi fil-progressjoni tal-kanċer tal-kolon avvanzat.Għalhekk, analizzajna t-traskriptomi tal-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum (SW480 u SW620) bl-użu tas-sekwenzjar tal-RNA u ġbarna xi lncRNAs funzjonali potenzjali mil-letteratura ppubblikata.Ibbażat fuq dawn ir-riżultati, iddisinja librerija sgRNA miġbura li fiha 7355 oligos sgRNA li jimmiraw 971 lncRNAs assoċjati mal-kanċer u 500 oligos sgRNA mhux immirati għal kontroll negattiv (Data Supplimentari 1).
Rappreżentazzjoni skematika tal-iskrinjar bl-użu tas-sistema CRISPRi.b arrikkiment sgRNA wara l-iskrinjar.Il-linja orizzontali bit-tikek tirrappreżenta log2 (bidla darbiet) = ±0.58.Il-linja bit-tikek vertikali tindika valur p = 0.05.It-tikek suwed jirrappreżentaw sgRNA mhux fil-mira (magħmul bħala NC).It-tikek ħomor huma sgRNAs li jimmiraw għal DARS-AS1.It-tikek blu huma sgRNAs li jimmiraw lil LINC00205, lncRNA onkoġeniku deskritt qabel.tinja bidla = (qari normalizzat, jum 17)/(qari normalizzat, jum 0).c DARS-AS1 knockdown sgRNA inibit it-tkabbir taċ-ċelluli.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw ± devjazzjoni standard tat-tliet esperimenti.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 test t tal-Istudent b'żewġ denbu.d Espressjoni DARS-AS1 fit-tumuri (sett tad-dejta TCGA).em Espressjoni ta 'DARS-AS1 f'par kampjuni normali u tumur minn pazjenti b'BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, u COAD, rispettivament (sett tad-dejta TCGA).Il-valuri p nkisbu bl-użu tat-test t tal-Istudent b'żewġ denbu.
Wara li bnejna l-plasmid u ppakkja l-lentivirus, transducejna l-linja taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum dCas9-SW620 bil-librerija ta 'hawn fuq f'erba' esperimenti ta 'infezzjoni indipendenti.Il-multipliċità ta 'infezzjoni (MOI) għal dawn l-infezzjonijiet kienet 0.1-0.3, li jindika li kull ċellula tista' tiġi trasfettata biss b'sgRNA wieħed.Wara 18-il jum ta 'kultura in vitro, il-profil ta' arrikkiment ta 'sgRNAs fil-mira naqas jew żdied wara l-iskrining, filwaqt li n-numru ta' oligonukleotidi ta 'kontroll mhux immirati baqa' relattivament mhux mibdul meta mqabbel mal-profil ta 'qabel l-iskrinjar, li jindika li l-mira tagħna għandha speċifika ħafna għall-iskrin. Librerija.Ross.1b u tabella supplimentari 1). LINC00205, li qabel kien irrappurtat li jippromwovi l-kanċer tal-pulmun u l-progressjoni tal-kanċer tal-fwied58,59,60, ġie skrinjat (log2 (foldchange) <-0.58, valur p <0.05), li jikkonferma l-affidabilità ta 'dan l-iskrining (Fig. 1b). LINC00205, li qabel kien irrappurtat li jippromwovi l-kanċer tal-pulmun u l-progressjoni tal-kanċer tal-fwied58,59,60, ġie skrinjat (log2 (foldchange) <-0.58, valur p <0.05), li jikkonferma l-affidabilità ta 'dan l-iskrining (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, li qabel kien irrappurtat li jippromwovi l-progressjoni tal-kanċer tal-pulmun u l-kanċer tal-fwied58,59,60, ġie eskluż (log2 (bidla darbiet) <-0.58, valur p <0.05), li jikkonferma r-robustezza ta 'dan l-iskrining (Fig. .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 筛 选 （（（（（（倍数 变化 变化）） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， ， 证实 证实 证实 了 了 该 筛选 可靠性 图 1B）。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 筛 选 （（（（（（倍数 变化 变化）） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， ， 证实 证实 证实 了 了 该 筛选 可靠性 图 1B）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, li qabel kien irrappurtat li jippromwovi l-progressjoni tal-kanċer tal-pulmun u tal-fwied58,59,60, ġie eskluż (log2 (bidla darbiet) <-0.58, valur p <0.05), li jikkonferma r-robustezza ta 'dan l-iskrining (Fig. .1b).
Fost l-lncRNAs kollha ttestjati, DARS-AS1 ġie wkoll skrinjat, bit-tliet oligonucleotides sgRNA konnessi mnaqqsa b'mod sinifikanti wara 18-il jum ta 'kultura, li jissuġġerixxi li knockdown ta' dan lncRNA irriżulta fi proliferazzjoni mnaqqsa tal-kanċer (Fig. 1b).Dan ir-riżultat kien appoġġjat aktar minn analiżi MTS fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-kolorektum li turi li r-rata ta 'tkabbir taċ-ċelloli knockdown DARS-AS1 kienet biss bin-nofs meta mqabbla ma' ċelloli ta 'kontroll (Figura 1c) u kienet konsistenti ma' rapporti preċedenti ta 'diversi tipi oħra ta' kanċer.: kanċer tal-kliewi taċ-ċelluli ċari, kanċer tat-tirojde u kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar51,52,53,55.Madankollu, il-funzjoni tagħha u l-mekkaniżmi molekulari fil-kanċer tal-kolorektum għadhom mhux esplorati.Għalhekk, għażilna dan l-lncRNA għal aktar studju.
Biex nistudjaw l-espressjoni DARS-AS1 f'pazjenti, analizzajna b'mod komprensiv 10,327 kampjun tat-tumur mill-proġett Cancer Genome Atlas (TCGA).Ir-riżultati tagħna juru li DARS-AS1 huwa espress b'mod wiesa 'u regolat b'mod sinifikanti f'ċelloli b'saħħithom f'varjetà ta' tumuri, inkluż adenokarċinoma tal-kolon (COAD), karċinoma taċ-ċelluli ċari tal-kliewi (KIRC), u karċinoma taċ-ċelluli papillari renali (KIRP)..Ftit ħafna (Fig. 1d u Fig. Supplimentari 1a, b). Analiżi ta’ kampjuni ta’ par b’saħħithom/tumur ikkonfermat aktar espressjoni ogħla b’mod sinifikanti ta’ DARS-AS1 fit-tumuri tal-karċinoma uroteljali tal-bużżieqa tal-awrina (BLCA), karċinoma taċ-ċelluli ċari tal-kliewi (KIRC), adenokarċinoma tal-prostata (PRAD), karċinoma taċ-ċelluli squamous tal-pulmun (LUSC) , karċinoma endometrijali tal-korp utru (UCEC), adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD), karċinoma epatoċellulari tal-fwied (LIHC), karċinoma taċ-ċelluli papillari tal-kliewi tal-kliewi (KIRP), u adenokarċinoma tal-kolon (COAD) (valur p < 0.05) (Fig. 1e-m) . Analiżi ta’ kampjuni ta’ par b’saħħithom/tumur ikkonfermat aktar espressjoni ogħla b’mod sinifikanti ta’ DARS-AS1 fit-tumuri tal-karċinoma uroteljali tal-bużżieqa tal-awrina (BLCA), karċinoma taċ-ċelluli ċari tal-kliewi (KIRC), adenokarċinoma tal-prostata (PRAD), karċinoma taċ-ċelluli squamous tal-pulmun (LUSC) , karċinoma endometrijali tal-korp utru (UCEC), adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD), karċinoma epatoċellulari tal-fwied (LIHC), karċinoma taċ-ċelluli papillari tal-kliewi tal-kliewi (KIRP), u adenokarċinoma tal-kolon (COAD) (valur p < 0.05) (Fig. 1e-m) .Analiżi ta 'kampjuni paired b'saħħithom/tumur ikkonfermat ukoll espressjoni ogħla b'mod sinifikanti ta' DARS-AS1 f'karċinoma uroteljali tal-bużżieqa tal-awrina (BLCA), karċinoma taċ-ċelluli ċari tal-kliewi u tal-kliewi (KIRC), adenokarċinoma tal-prostata (PRAD), tumuri tal-karċinoma taċ-ċelluli squamous tal-pulmun (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , karċinoma endometrijali tal-korpus uteri (UCEC), adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD), karċinoma epatoċellulari tal-fwied (LIHC), karċinoma taċ-ċelluli papillari tal-kliewi (KIRP), u adenokarċinoma tal-kolon (COAD) (valur p < 0.05) (Fig. 1e– m).配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 细胞癌 (KIRC) 、 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 中显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 证实 了 Dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analiżi ta 'kampjuni b'par b'saħħithom/tumur appoġġjat aktar ir-rwol ta' DARS-AS1 f'karċinoma uroteljali tal-bużżieqa tal-awrina (BLCA), karċinoma taċ-ċelluli renali taċ-ċelluli ċari (KIRC), adenokarċinoma tal-prostata (PRAD), u tumuri tal-karċinoma taċ-ċelluli squamous tal-pulmun (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). espressjoni f'karċinoma tal-utru corpus (UCEC), adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD), karċinoma epatoċellulari (LIHC), karċinoma taċ-ċelluli papillari renali (KIRP), u adenokarċinoma tal-kolon (COAD) (valur p <0.05) (Figura 1e -m).Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jindikaw li DARS-AS1 huwa espress b'mod wiesa 'u ħafna f'varjetà ta' kanċers.
Minħabba li DARS-AS1 u DARS (il-ġene li jikkodifika l-linja antisens) jaqsmu l-istess promotur u jinsabu ħdejn xulxin, iddisinjajna shRNA biex inaqqas speċifikament DARS-AS1 iżda mhux DARS (Figura Supplimentari 2a, b u Tabella Supplimentari 2) .Minbarra SW620, użajna wkoll tliet linji ta 'ċelluli oħra li jesprimu ħafna DARS-AS1 biex nistudjaw l-effikaċja u l-funzjoni ta' knockdown shRNA (Tabella Supplimentari 3).Ir-riżultati tagħna indikaw li t-tliet shRNAs kollha żviluppati kisbu mill-inqas 80% effiċjenza ta 'knockdown DARS-AS1 bi ftit effett fuq l-ammont ta' DARS mRNA (Figura Supplimentari 2c-f).Barra minn hekk, sibna li DARS-AS1 knockdown ma 'dawn shRNAs inibit b'mod sinifikanti t-tkabbir taċ-ċelluli fil-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum SW620 (49.7%) u HCT116 (27.7%), linja taċ-ċelluli tal-kanċer tas-sider MBA-MD-231 (53.4%).) u l-linja taċ-ċelluli tal-hepatoma HepG2 (tnaqqis ta '92.7%), kif ukoll il-kapaċità tagħhom li jiffurmaw sferi mhux ankrati (tnaqqis medju ta' ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% u 75.7% għal kull linja taċ-ċelluli) (Fig. 2a, b).F'SW620, ir-riżultati tal-assaġġ tal-formazzjoni tal-kolonji kkonfermaw aktar li DARS-AS1 shRNA inibixxi b'mod sinifikanti l-proliferazzjoni taċ-ċelluli bi tnaqqis medju ta 'madwar 69.6% (Fig. 2c).
Effett ta 'kontroll shRNA u DARS-AS1 shRNA fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli (a) u l-formazzjoni ta' spherojdi (b) fiċ-ċelloli SW620, HCT116, MBA-MD-231 u HepG2.c Effett ta 'kontroll shRNA u DARS-AS1 shRNA fuq il-formazzjoni tal-kolonji fiċ-ċelloli SW620.Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli (d), il-formazzjoni tal-isferojdi (e), u l-formazzjoni tal-kolonji (f) ta 'ċelluli SW620 li jesprimu żżejjed DARS-AS1.Id-dejta murija hija l-medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, u *** p ≤ 0.001 permezz tat-test t tal-Istudent b'żewġ denbu.
Biex nikkumplimentaw studji ta 'telf ta' funzjoni, imbagħad ħloqna ċelluli SW620 li jesprimu żżejjed DARS-AS1 (Fig. 2g Supplimentari).L-espressjoni żejda DARS-AS1 żiedet b'mod sinifikanti t-tkabbir taċ-ċelluli (1.8 darbiet), il-formazzjoni ta' spherojdi mhux ankrati (1.4 darbiet), u l-formazzjoni ta 'kolonji (3.3 darbiet) fiċ-ċelloli SW620 (Fig. 2d-f).Aħna kkonfermajna dan ir-riżultat bl-użu ta 'linja taċ-ċelluli oħra li tesprimi DARS-AS1, A549.Din il-proliferazzjoni msaħħa taċ-ċelluli minħabba l-espressjoni żejda DARS-AS1 ġiet osservata aktar fiċ-ċelloli A549 (Figura Supplimentari 2h, i u Tabella Supplimentari 3).Meħuda flimkien, dawn l-istudji dwar il-qligħ u t-telf juru li DARS-AS1 jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer in vitro.
Biex tesplora l-mekkaniżmu sottostanti li bih DARS-AS1 jirregola l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, għamilna analiżi pull-down tal-RNA biex nidentifikaw l-imsieħba potenzjali tagħha li jorbtu mal-proteini.Ir-riżultati ta 'RT-qPCR wrew li madwar 86.2% ta' DARS-AS1 jinsab fiċ-ċitoplażma taċ-ċelluli SW620 (Fig. 3a Supplimentari).Il-DARS-AS1 jew pseudoRNA bijotinilat traskritt in vitro ġie mbagħad inkubat b'lisati taċ-ċelluli SW620 segwiti minn separazzjoni SDS-PAGE.Tbajja tal-fidda sussegwenti wriet li faxxa distinta (~ 38 kDa) kienet arrikkita b'mod sinifikanti f'kampjuni ta 'ġibda DARS-AS1 iżda mhux f'kampjuni ta' RNA finta jew żibeġ (Fig. 3a).Din il-medda ġiet identifikata bħala proteina attivanti PKR (PACT) mill-ispettrometrija tal-massa (MS) u kkonfermata aktar minn immunoblotting fil-linji taċ-ċelluli SW620, HCT116, u HepG2 (Fig. 3a, b).L-arrikkiment tad-DARS u proteini PACT relatati - PKR u TRBP - ġie investigat ukoll bl-użu ta 'analiżi RNA permezz ta' Western blotting (WB).Ir-riżultati indikaw li ma nstabet l-ebda interazzjoni diretta bejn DARS-AS1 RNA u dawn it-tliet proteini (Fig. 3b Supplimentari).L-interazzjoni speċifika bejn DARS-AS1 u PACT ġiet ikkonfermata aktar mill-analiżi tal-immunopreċipitazzjoni tal-RNA (RIP), li wriet li DARS-AS1 kien arrikkit b'mod sinifikanti f'antikorpi anti-PACT iżda mhux RNAs ta 'kontroll oħra (Figura 3c).Biex jiġi ddeterminat jekk DARS-AS1 jinteraġixxix direttament ma 'PACT fin-nuqqas ta' xi komponenti ċellulari oħra, sar assaġġ in vitro tal-biolayer interferometry (BLI) bl-użu ta 'PACT purifikat.DARS-AS1 jew RNA finta ttikkettjati bil-bijotina ġew immobilizzati fuq bijosensuri streptavidin (SA) u mbagħad inkubati f'buffer kinetiku li fih 1 μM PACT.Notevolment, PACT marbut b'mod qawwi ma' DARS-AS1 (valur KD ~ 26.9 nM), iżda mhux biex jimita l-RNA (Figura 3d).Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati juru interazzjoni diretta u affinità għolja bejn DARS-AS1 u PACT.
L-analiżi tal-ġibda tal-RNA identifikat DARS-AS1 li jinteraġixxi ma 'PACT fiċ-ċelloli SW620.Fuq, tbajja tal-fidda ta 'proteini relatati.Twettqu immunoblots aktar baxxi b'antikorp anti-PACT.b Analiżi pull-down tal-RNA saret fiċ-ċelloli HCT116 (fuq) u HepG2 (ta' isfel).L-arrikkiment tal-PACT ġie skopert permezz ta' immunoblotting.Twettqu analiżi tal-immunopreċipitazzjoni tal-cRNA (RIP) f'ċelloli SW620 bl-użu tal-antikorpi indikati.d Il-kurvi tal-irbit tal-PACT ma' DARS-AS1 ta' tul sħiħ jew RNA ta' kontroll inkisbu bl-użu tal-interferometrija tal-bijosaff (BLI).L-RNA kien immobilizzat fuq biosensor ta 'streptavidin.1 μM PACT intuża biex titkejjel l-assoċjazzjoni.L-assaġġ tal-ġibda tal-RNA sar bl-użu ta' DARS-AS1 ta' tul sħiħ bijotinilat jew maqtugħ (fuq).Immunoblot li juri PACT riċevut (qiegħ).f PACT immarkat purifikat ġie inkubat b'DARS-AS1 ta' tul sħiħ bijotinilat jew maqtugħ (bħal f'e) għal analiżi RIP in vitro.L-RNA estratt ġie vverifikat b'RT-qPCR.g L-affinità relattiva ta 'frammenti ta' RNA differenti għal PACT inkisbet bl-użu ta 'interferometrija ta' bijosaff.Għall-analiżi, intużaw 100 nM RNA u 1 μM RAST.h Twettqu assaġġi RIP in vitro bl-użu ta' PACT purifikat intatt jew maqtugħ bit-tikketta.L-RNA estratt ġie vverifikat b'RT-qPCR.i Rata ta' tkabbir ta' ċelluli SW620 li jesprimu żżejjed DARS-AS1, PACT, jew it-tnejn.j Espressjoni żejda ta 'DARS-AS1 ta' tul sħiħ jew maqtugħ fiċ-ċelloli SW620 kellha effetti differenti fuq it-tkabbir taċ-ċelluli.k Apoptożi ġiet skoperta permezz ta 'immunoblotting b'antikorp anti-PARP.l Knockout ta 'DARS-AS1 jinduċi apoptosi taċ-ċelloli SW620 kif muri miċ-ċitometrija tal-fluss.Id-dejta murija hija l-medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, permezz tat-test t tal-Istudent b'żewġ denbu. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, permezz tat-test t tal-Istudent b'żewġ denbu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 permezz tat-test t tal-Istudent b'żewġ denbu. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 permezz tat-test t tal-Istudent b'żewġ denbu.
Imbagħad iġġeneraw tliet frammenti ta 'RNA DARS-AS1 bijotinilati permezz ta' traskrizzjoni in vitro biex nidentifikaw ir-reġjun DARS-AS1 meħtieġ għall-assoċjazzjoni PACT (Figura 3e).Ir-riżultati tal-analiżi tal-RNA wrew li kull framment kien kapaċi jinteraġixxi ma 'PACT, iżda r-reġjun 3'-terminal (384-768 nukleotidi ttikkettjati A3) wera aktar minn 1-384 nukleotidi ttikkettjati A1) (Fig. 3e).Riżultati simili ġew osservati fl-assaġġ RIP in vitro bl-użu ta 'PACT rikombinanti (Figura 3f).B'mod konsistenti ma 'dawn ir-riżultati, esperimenti biex jorbtu frammenti ta' RNA immobilizzati ma 'PACT bl-użu ta' BLI wrew ukoll li PACT għandu affinità ogħla għal A3 (384-768 nt) (valur KD ta 'madwar 94.6 nM), filwaqt li kważi l-ebda konnessjoni ma' żoni oħra.(Fig. 3d).
Aħna eżaminajna wkoll ir-reġjuni vinkolanti assoċjati fil-PACT.PACT fih tliet oqsma funzjonali, li tnejn minnhom huma kkonservati double-stranded RNA-binding domains (dsRBD) u t-tielet dominju (magħmul D3) li jaġixxi bħala attivatur tal-interazzjonijiet tal-proteini.Biex neżaminaw il-kapaċità tal-irbit tal-lncRNA ta 'kull dominju, inġinejna tliet mutazzjonijiet li neħħew kull wieħed mit-tliet oqsma u wettaqna assaġġ RIP in vitro.Ir-riżultati tagħna wrew li t-tħassir tat-tielet dominju (D3) ta 'PACT naqqas b'mod sinifikanti l-interazzjoni tiegħu ma' DARS-AS1 (b'0.11 darbiet meta mqabbel ma 'PACT intatt) meta mqabbel ma' żewġ mutazzjonijiet l-oħra (Fig. 3h), intwera li r-rilaxx ta' D3 interaġixxa ma' DARS.-AC1.Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-interazzjoni bejn DARS-AS1 u PACT tista 'sseħħ primarjament permezz tat-tarf 3' ta' DARS-AS1 u d-dominju D3 ta 'PACT.
Aħna nnutajna li DARS-AS1 ma kellu l-ebda effett fuq l-espressjoni PACT u PACT ma kellu l-ebda effett fuq DARS-AS1 (Fig. 3c Supplimentari).Imbagħad eżaminajna l-effett tat-tnaqqis tal-PACT fuq it-tkabbir taċ-ċelluli.B'kuntrast ma 'DARS-AS1, ċelluli relattivi kibru 1.5-3 darbiet aktar malajr meta PACT ġie knocked down (Figura Supplimentari 3d).Ir-riżultati tal-assaġġ tal-formazzjoni tal-kolonji indikaw li ċ-ċelloli ffurmaw kolonji ta '2-3 darbiet wara trattament ta' shRNA b'PACT (Fig. 3e Supplimentari).Biex tittestja jekk DARS-AS1 jirregolax il-proliferazzjoni taċ-ċelluli permezz tal-PACT, aħna ġġeneraw ċelluli SW620 li jesprimu żżejjed PACT, DARS-AS1, jew it-tnejn.L-espressjoni żejda tal-PACT wriet inibizzjoni sinifikanti tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli (Figura 3i).Filwaqt li l-espressjoni żejda DARS-AS1 per se promossa b'mod sinifikanti l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fir-rata ta 'tkabbir taċ-ċelloli li jesprimu ż-żejjed DARS-AS1 u PACT.Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li PACT jista 'jikkontrobatti ż-żieda fil-proliferazzjoni kkawżata minn espressjoni żejda DARS-AS1.
Peress li reġjuni differenti ta 'DARS-AS1 għandhom abbiltajiet differenti ta' rbit ta 'PACT, investigajna l-influwenza relattiva tagħhom fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli permezz ta' espressjoni żejda differenti ta 'frammenti DARS-AS1.Meta mqabbel maż-żewġ frammenti l-oħra, DARS-AS1 kien espress iżżejjed fit-tarf 3 '(384-768 nt), ir-reġjun prinċipali relatat mal-PACT f'DARS-AS1, li kellu l-ogħla kapaċità li jistimula l-proliferazzjoni taċ-ċelluli (Fig. 3j).Dawn ir-riżultati jindikaw korrelazzjoni pożittiva bejn il-kapaċità ta 'rbit u l-funzjoni bijoloġika ta' DARS-AS1.
PACT ġie rrappurtat li huwa proteina pro-apoptotika19.Għalhekk, investigajna l-effett ta 'DARS-AS1 fuq l-apoptosi.Kif mistenni, DARS-AS1 knockdown żiedet b'mod sinifikanti l-qsim PARP fiċ-ċelloli SW620 u żiedet il-proporzjon ta 'ċelluli pożittivi tal-annexin V f'linji taċ-ċelluli SW620, HCT116, HepG2 u MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f–h), li jindika li l-effett anti-apoptotiku ta 'DARS-AS1 fiċ-ċelloli tal-kanċer huwa oppost għall-funzjoni li tinduċi l-apoptożi ta' PACT.Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-mekkaniżmu tal-funzjoni onkoġenika DARS-AS1 jista 'jkun permezz ta' inibizzjoni tal-funzjoni PACT.
Sussegwentement, esplorajna l-implikazzjonijiet funzjonali tal-assoċjazzjoni DARS-AS1-PACT.PACT ġie rrappurtat li jattiva PKR permezz ta 'interazzjoni diretta, li sussegwentement ittejjeb il-fosforilazzjoni ta' eIF2α, u tikkawża tħassir tat-traduzzjoni u apoptożi17.L-ewwel, eżaminajna jekk DARS-AS1 taffettwax il-lokalizzazzjoni ċellulari ta 'PACT u PKR.Il-mikroskopija ta 'fluworexxenza konfokali wriet li PACT u PKR kienu kolokalizati ħafna fiċ-ċelloli SW620 b'koeffiċjent medju ta' korrelazzjoni Pearson ta '0.72.Sadanittant, l-espressjoni żejda DARS-AS1 naqqset b'mod sinifikanti l-ko-lokalizzazzjoni PACT u PKR (koeffiċjent medju ta 'korrelazzjoni Pearson 0.61) (Figura 4a).Biex tinvestiga jekk DARS-AS1 jistax jimmodula l-interazzjoni PACT-PKR, għamilna assaġġ ta 'ko-immunoprecipitation (co-IP) b'antikorp anti-PACT f'lysates taċ-ċelluli SW620.PKR kien arrikkit ħafna fl-anti-PACT fiċ-ċelloli ta 'kontroll, filwaqt li l-irkupru ta' PKR kien imnaqqas b'mod sinifikanti f'lysates minn ċelloli li jesprimu żżejjed DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT u PKR ittikkettjati purifikati ntużaw għal testijiet in vitro ta' rabta mal-proteini.Għaldaqstant, dawk li pprovdew DARS-AS1 iżda l-ebda RNA ta 'kontroll urew interazzjoni PACT-PKR mrażżna (Figura 4c).Ir-riżultati kollha wrew li DARS-AS1 ħarbat il-komunikazzjoni PACT u PKR.
Ġiet osservata Ko-lokalizzazzjoni ta' PACT u PKR f'ċelloli ta' kontroll jew ċelloli li jesprimu DARS-AS1 iżżejjed bl-użu ta' mikroskopija ta' fluworexxenza konfokali.In-nuklei kienu mtebbgħin b'DAPI.Riżultati statistiċi nkisbu minn 16-il ritratt.b Ko-immunopreċipitazzjoni (co-IP) bl-użu ta' antikorp anti-PACT f'lisati taċ-ċelluli ta' ċelluli ta' kontroll SW620 jew ċelluli li jesprimu żżejjed DARS-AS1.c PACT ittikkettat, PKR purifikat u traskritt in vitro b'DARS-AS1 jew mock RNA ġew inkubati għal analiżi in vitro tat-twaħħil tal-proteini.Antikorpi kontra l-bandiera ntużaw għall-immunopreċipitazzjoni.d Twettqu immunoblots bl-antikorpi indikati f'ċelloli SW620 u HCT116 trasfettati b'shRNA ta 'kontroll jew DARS-AS1-shRNA segwiti minn ġuħ fis-serum.Il-livelli ta' espressjoni DARS-AS1 biddlu s-sensittività ċellulari għal thapsigargin.Iċ-ċelloli SW620 ġew trasfettati bi shRNA DARS-AS1, plasmid ta 'espressjoni żejda DARS-AS1 jew plasmid ta' kontroll.Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'thapsigargin għal 48 siegħa u l-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet iddeterminata bl-użu tar-reaġent MTS.f DARS-AS1 traskritt in vitro jew RNA finta u PACT purifikat intużaw għal analiżi ta' attivazzjoni in vitro u skoperta ta' immunoblot.g Immunoblots li jużaw dawn l-antikorpi saru fuq ċelluli SW620-ctrl (xellug) jew ċelluli li jesprimu żżejjed mutanti PKR (lemin).Dawn iċ-ċelloli mbagħad ġew trasfettati b'shRNA ta' kontroll jew DARS-AS1-shRNA segwit minn ġuħ fis-serum.h Iċ-ċitometrija tal-fluss uriet li l-inattivazzjoni tal-mutant PKR kkumpensat għall-apoptosi indotta minn DARS-AS1 fiċ-ċelloli SW620.i Immunoblots bl-antikorpi indikati saru f'ċelluli SW620 (xellug) jew HCT116 (lemin).Ċelloli trasfettati b'shRNA ta 'kontroll jew DARS-AS1 shRNA huma mċaħħda mis-serum u supplimentati b'inibitur PKR C16 ta' 100 nM jew DMSO.Skala bar = 5 µm.Id-dejta murija hija l-medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti.* p ≤ 0.05 test t tal-Istudent b'żewġ denbu.
Huwa ġeneralment maħsub li ladarba PACT jinteraġixxi ma 'PKR17, il-fosforilazzjoni ta' PKR f'Thr451 tista 'tiġi indotta.Ir-riżultati tagħna indikaw li l-livell ta 'fosforilazzjoni PKR kien elevat b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli knockdown DARS-AS1 wara l-ġuħ tas-serum (Fig. 4d u Supplimentari Fig. 4a).Għaldaqstant, sibna li l-fosforilazzjoni ta 'eIF2α, is-sottostrat ewlieni tal-PKR, żdiedet ukoll b'mod sinifikanti minn DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d u Supplimentari Fig. 4a).Thapsigargin huwa stressor ER li jikkawża li l-ER jirrilaxxa Ca2+.It-trattament b'thapsigargin ġie rrappurtat li jinduċi l-espressjoni u l-attivazzjoni ta 'PACT, li aktar jinteraġixxi ma' u jattiva PKR, li jwassal għal apoptożi billi żżid il-fosforilazzjoni ta 'eIF2α 18,61.Hawnhekk, użajna thapsigargin bħala stimulatur tal-mogħdija PACT/PKR biex ninvestigaw jekk DARS-AS1 jistax jgħin liċ-ċelloli jegħlbu l-istress billi jinibixxi l-mogħdija PACT/PKR.Aħna osservajna li l-livell ta 'espressjoni DARS-AS1 ikkorrelata b'mod pożittiv mar-reżistenza taċ-ċelluli għal thapsigargin.Iċ-ċelluli SW620 li jesprimu żżejjed DARS-AS1 baqgħu ħajjin aħjar meta ġew ittrattati b'thapsigargin, filwaqt li ċ-ċelluli bi knockdown DARS-AS1 saru aktar suxxettibbli (Fig. 4e).B'mod konsistenti ma 'dawn ir-riżultati, l-espressjoni żejda DARS-AS1 naqqset il-fosforilazzjoni PKR indotta minn thapsigargin (Fig. 4b Supplimentari).B'kuntrast, wara t-trattament ta 'thapsigargin, PKR u eIF2α ġew fosforilati b'mod ogħla fiċ-ċelloli knockdown DARS-AS1 meta mqabbla ma' ċelloli ta 'kontroll (Fig. 4b Supplimentari).Interessanti, thapsigargin indotta espressjoni DARS-AS1 b'mod dipendenti mid-doża, li jista 'jindika funzjoni kontra l-istress ta' DARS-AS1 (Figura Supplimentari 4c).Barra minn hekk, wettaqna testijiet ta 'attivazzjoni in vitro biex nikkonfermaw dawn l-osservazzjonijiet.Fil-qosor, PKR ġie purifikat minn lisati taċ-ċelluli bl-użu ta 'antikorp anti-PKR, imbagħad inkubat b'PACT rikombinanti u DARS-AS1 traskritt in vitro.Wara r-reazzjoni enżimatika, il-fosfo-PKR ġie skopert bl-użu ta 'WB.Ir-riżultati tagħna indikaw li l-fosforilazzjoni PKR kienet inibita b'mod sinifikanti minn DARS-AS1, iżda mhux mill-RNA ta 'kontroll (Figura 4f).Dawn ir-riżultati in vitro u in vivo jissuġġerixxu li DARS-AS1 jinibixxi l-attivazzjoni PKR medjata minn PACT.Fl-istess ħin, osservajna wkoll tnaqqis fl-irkupru tal-PACT fil-preżenza ta 'DARS-AS1 (Figura 4f).Dan ir-riżultat huwa konsistenti mar-riżultati tal-assaġġ tal-irbit tal-proteini in vitro (Figura 4c) u għal darb'oħra juri l-funzjoni ta 'imblukkar ta' DARS-AS1 għall-assoċjazzjoni PACT-PKR.
Ser246 u Ser287 fid-dominju D3 ta 'PACT huma meħtieġa għall-attivazzjoni ta' PKR taħt stress ċellulari.Is-sostituzzjoni ta 'żewġ residwi ta' serine għal alanine tat PACT mutant (mutD), li attivat PKR fin-nuqqas ta 'stress, u s-sostituzzjoni għal alanine (mutA) reġġa' lura l-protokoll.Peress li wrejna l-importanza ta 'dan id-dominju f'assoċjazzjoni diretta ma' DARS-AS1, aħna ġġenerajna dawn iż-żewġ mutanti PACT biex nittestjaw jekk dawn ir-residwi jistgħux ikunu involuti wkoll fl-interazzjoni ma 'DARS-AS1.Interessanti, iż-żewġ mutanti tilfu l-abbiltà li jorbtu ma 'DARS-AS1 (Figura Supplimentari 4d), li jissuġġerixxi li l-istruttura sħiħa tal-proteina PACT tista' tkun meħtieġa għal interazzjoni effiċjenti ma 'DARS-AS1.
Barra minn hekk, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu wkoll li l-inibizzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli indotta minn DARS-AS1-shRNA tista 'tiġi parzjalment restawrata billi tiġi espressa żżejjed mutant PACT negattiv dominanti (PACTmutA) jew mutant PKR negattiv dominanti (PKRmut) (Fig. Supplimentari 4e. e).Espressjoni eċċessiva ta 'mutanti PKR dominanti negattivi naqqset fosforilazzjoni PKR indotta minn knockdown DARS-AS1 kif ukoll fosforilazzjoni eIF2α f'ċelluli mċaħħda mis-serum (Fig. 4g).Aktar importanti minn hekk, il-proporzjon ta 'ċelloli apoptotiċi indotti minn knockdown DARS-AS1 tnaqqset ukoll f'ċelloli li jesprimu PKRmut iżżejjed (Fig. 4h u Fig. 4g Supplimentari).L-inibizzjoni tal-attività PKR kinase tfixkel ukoll il-funzjoni DARS-AS1, peress li r-riżultati wrew li l-knockdown DARS-AS1 rarament wassal għal fosforilazzjoni ta 'PKR u eIF2α meta ċ-ċelloli ġew ittrattati b'inibitur C16 speċifiku għal PKR (Fig. 4i u Fig. 4h Supplimentari).).Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li DARS-AS1 jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, għall-inqas parzjalment, billi jinibixxi l-attivazzjoni PKR medjata minn PACT.
Biex nesploraw aktar ir-rwol ta 'DARS-AS1 fit-tumoriġenesi, għamilna esperimenti in vivo bl-użu ta' mudell xenograft tal-ġurdien. Ir-riżultati juru li t-twaqqigħ ta 'DARS-AS1 naqqas b'mod drammatiku t-tkabbir tat-tumur fil-ġrieden (valur p <0.0001) (Fig. 5a). Ir-riżultati juru li t-twaqqigħ ta 'DARS-AS1 naqqas b'mod drammatiku t-tkabbir tat-tumur fil-ġrieden (valur p <0.0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значера и 0.10). Ir-riżultati juru li l-knockdown DARS-AS1 inaqqas drastikament it-tkabbir tat-tumur fil-ġrieden (valur p <0.0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей у мышей (зна0.1) < сначительно снижает рост опухоли у мышей (зна 0.5). Ir-riżultati wrew li l-knockdown DARS-AS1 naqqas b'mod sinifikanti t-tkabbir tat-tumur fil-ġrieden (valur p <0.0001) (Figura 5a).Għalhekk, fil-grupp ta 'knockdown DARS-AS1, kien hemm tnaqqis sinifikanti fil-volum medju tat-tumur b'madwar 72.9% u massa medja tat-tumur b'madwar 87.8% (Figura 5b-d).Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu bil-qawwa li DARS-AS1 jista 'jippromwovi b'mod sinifikanti t-tkabbir tat-tumur in vivo.
Effetti ta 'knockdown ad DARS-AS1 fuq l-onkoġenesi tal-kolorektum fil-ġrieden nude.Il-kurvi tat-tkabbir (a), id-daqs tat-tumur (b), il-piż (c), u l-immaġini tat-tumur (d) huma murija.Il-vireg tal-iżball jirrappreżentaw ± SEM. n = 10. ****p < 0.0001, permezz tat-test t ta' Student b'żewġ denbu. n = 10. ****p < 0.0001, permezz tat-test t ta' Student b'żewġ denbu. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 test t tal-Istudent b'żewġ denbu.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 test t tal-Istudent b'żewġ denbu.e Kaplan-Meier analizzat il-korrelazzjoni bejn il-livelli ta 'espressjoni DARS-AS1 u s-sopravivenza ġenerali f'pazjenti b'UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, u LGG.Livelli għoljin ta 'espressjoni DARS-AS1 fil-pazjenti kienu fl-ogħla 50%;il-livell baxx ta 'espressjoni DARS-AS1 fil-pazjenti kien fl-aħħar 50%.Il-valuri p ġew determinati bl-użu tat-test tal-log rank.f Mudell propost li fih DARS-AS1 jirregola l-mogħdija PACT-PKR u t-tkabbir tat-tumur.
Biex nifhmu aħjar l-impatt kliniku ta 'DARS-AS1, eżaminajna l-korrelazzjoni bejn l-espressjoni tiegħu u s-sopravivenza tal-pazjent.Billi analizzat is-sett tad-dejta TCGA, sibna li espressjoni ogħla DARS-AS1 kienet assoċjata ma 'melanoma uveali (UVM), kromofobija renali (KICH), karċinoma taċ-ċelluli papillari renali (KIRP), mesoteljoma (MESO), multiplex.Sopravivenza aktar baxxa kienet assoċjata b'mod sinifikanti ma 'morfożi tal-glioblastoma (GBM) u pazjenti bi glijoma tal-moħħ ta' grad baxx (LGG) (Figura 5e).Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li DARS-AS1 jista 'jkollu rwol importanti fil-progressjoni klinika tat-tumur u jista' jkun bijomarkatur potenzjali ta 'tbassir f'diversi kanċers.
F'dan l-istudju, bl-użu ta 'screening funzjonali ta' CRISPRi fuq skala kbira, iddeterminajna li DARS-AS1 lncRNA jegħleb l-istress taċ-ċelluli tal-kanċer billi jirregola żewġ rispons ewlenin għall-istress, PACT u PKR.Billi jinteraġixxi direttament ma 'PACT, DARS-AS1 inibixxi l-attivazzjoni ta' PKR medjata minn PACT, u b'hekk jipprevjeni l-mewt taċ-ċelluli apoptotiċi u jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli (Fig. 5f).L-upregulation ta 'DARS-AS1 ġiet osservata f'diversi tipi ta' kanċer, li tissuġġerixxi li l-funzjoni tagħha li tippromwovi s-sopravivenza taċ-ċelluli tal-kanċer taħt kundizzjonijiet stressanti tista 'tkun ġeneralment applikabbli għal diversi tipi ta' kanċer.
PACT ġie identifikat bħala proteina attivatur PKR, u l-attivazzjoni PKR medjata minn PACT għandha rwol importanti fir-risponsi għall-istress billi tirregola t-traskrizzjoni, it-traduzzjoni, l-apoptożi, u proċessi ċellulari importanti oħra62.Għal għexieren ta 'snin, saru tentattivi biex jifhmu r-regolamentazzjoni speċifika għall-kanċer tal-kaskata PACT-PKR.Hawnhekk, l-istudju tagħna żvela mekkaniżmu differenti ta’ regolazzjoni ta’ PACT-PKR fiċ-ċelloli tal-kanċer permezz ta’ lncRNA ċellulari DARS-AS1, li jorbot direttament ma’ PACT, jimblokka l-interazzjoni PACT-PKR, jinibixxi l-attivazzjoni ta’ PKR u l-fosforilazzjoni ta’ eIF2α, u b’hekk jinibixxi l-apoptosi indotta mill-istress u tistimula l-proliferazzjoni eventwali tal-kanċer.ċelloli.Din l-iskoperta titfa’ dawl fuq miri potenzjali tal-lncRNA għall-pronjosi u t-terapija tal-kanċer.
Id-dejta tagħna wriet li l-knockdown DARS-AS1 jissensibilizza ċ-ċelloli għall-ġuħ tas-serum b'żieda sinifikanti fil-PKR fosforilat u eIF2α.Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li DARS-AS1 jippromwovi s-sopravivenza taċ-ċelluli tal-kanċer taħt kundizzjonijiet ħorox billi jinibixxi l-attività PACT/PKR.Diversi RNAs oħra li ma jikkodifikawx, bħal ASPACT u nc886, huma wkoll involuti fl-assi PACT/PKR billi jirregolaw PACT48 mRNA jew jirregolaw l-awtofosforilazzjoni billi jorbtu ma 'PKR49,50,64.Fosthom, DARS-AS1 jaġixxi bħala li jfixkel l-assoċjazzjoni PACT-PKR.Dan l-istudju jsaħħaħ il-fehim tagħna tar-regolamentazzjoni tal-assi PACT/PKR u r-rwol tal-lncRNAs fir-risponsi għall-istress.
PACT fih tliet oqsma separati.Kull wieħed mill-ewwel żewġ dsRBDs huwa biżżejjed biex jinkiseb rabta ta 'affinità għolja ta' PACT ma 'PKR, filwaqt li t-tielet dominju (D3) huwa meħtieġ għall-attivazzjoni ta' PKR in vitro u in vivo.L-istudju tagħna wera li DARS-AS1 jinteraġixxi preferenzjali mad-dominju D3 (Fig. 3h).Minħabba d-daqs kbir tal-lncRNA (768 nukleotidi), DARS-AS1 li jorbot ma 'D3 jista' jimpedixxi fiżikament l-interazzjoni bejn id-dominju PACT ta 'dsRBD u PKR, u b'hekk jimblokka l-assoċjazzjoni ta' PACT u PKR.Mutazzjonijiet tal-punt PACT li ssostitwixxew Ser246 u Ser287 f'D3 b'alanine jew aspartate ħarbtu l-affinità li torbot tiegħu għal DARS-AS1, u jindikaw l-importanza tal-proprjetajiet strutturali u elettriċi ġenerali ta 'D3 fl-assoċjazzjoni tagħhom.Aktar dettalji ta 'dan il-mekkaniżmu se jkunu meħtieġa fil-futur, bl-użu ta' analiżi bijokimika aktar preċiża u analiżi strutturali PACT b'riżoluzzjoni għolja.
Studji preċedenti rrappurtaw li DARS-AS1 jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli permezz ta 'diversi mekkaniżmi51,52,53.F'eżempju wieħed, l-investigaturi osservaw li DARS-AS1 irregola l-ġene DARS tiegħu li jikkodifika l-proteini antisens billi jimmira miP-194-5p fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-kliewi.Madankollu, fl-istudju preżenti, il-knockdown DARS-AS1 kellu ftit effett fuq it-traskrizzjoni DARS f'diversi tipi ta 'kanċer, inklużi mill-inqas kanċer tal-kolorektum, tas-sider u tal-fwied.Minħabba li lncRNAs juru mudelli ta 'espressjoni speċifiċi għaċ-ċelluli u għat-tessuti, il-mekkaniżmi funzjonali jistgħu ma jiġux konservati madwar it-tipi ta' kanċer, li jistgħu jikkontribwixxu għal din id-diskrepanza bejn l-osservazzjonijiet tagħna u l-valutazzjonijiet preċedenti ta 'kanċer differenti.Studji speċjali huma meħtieġa biex jiċċaraw il-mekkaniżmi speċifiċi ta 'diversi proċessi fiżjoloġiċi u patoloġiċi.
Analiżi ta 'dejta klinika wriet li l-espressjoni DARS-AS1 fit-tumuri hija inversament korrelata mas-sopravivenza ta' pazjenti bil-kanċer, li jenfasizza l-importanza tal-assi DARS-AS1/PACT/PKR fil-pronjosi tal-kanċer.Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li DARS-AS1 huwa regolatur tal-assi tas-sinjalar PACT/PKR, jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer, u jinibixxi l-apoptożi waqt ir-rispons għall-istress, li jipprovdi linja oħra ta 'riċerka u huwa ta' interess għal riċerka futura fi trattamenti potenzjali. .
Linji taċ-ċelluli umani SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 u HEK293T inkisbu mill-Infrastruttura Nazzjonali tar-Riżorsi tal-Linja taċ-Ċelloli fiċ-Ċina.Iċ-ċelloli kollha nżammu f'medja DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) supplimentati b'10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) u 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) f'37 ° C, 5% CO2.inkubatur.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Kontra l-Bandiera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfru S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfru S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);ġurdien normali IgG, CST (5415S);fenek normali IgG, CST (2729S).L-antikorpi ġew dilwiti 1:1000 f'PBST għal Western blotting u 1:100 għal IP.
sgRNAs ġew żviluppati bl-użu ta 'għodda disponibbli pubblikament imsejħa CRISPR-ERA66.Aħna użajna l-parametri ta 'l-għodda default għall-iżvilupp ta' sgRNA u l-algoritmu kkalkulat is-siti li jgħaqqdu sgRNA fir-reġjun ta '3 kb.iċċentrat fuq TSS.Għaqdiet ta 'oligonukleotidi sgRNA ġew sintetizzati f'CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) u kklonati fi plasmidi pgRNA umanizzati (Addgene #44248).Total ta’ 12 µg ta’ plasmid pgRNA umanizzat miġbur, 7.2 µg ta’ psPAX2 (Addgene #12260), u 4.8 µg ta’ pMD2.G (Addgene #12259) ġew ko-trasfettati f’5 x 106 HEK293T f’dixx ta’ transfezzjonijiet ta’ 10 ċm tad-DNA. ċelluli (CWBIO, Beijing, iċ-Ċina) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur.Supernatanti li fihom il-virus inġabru 48 u 72 siegħa wara t-trasfezzjoni u ffiltrati minn filtru ta' 0.45 µm.Għall-iskrinjar, ċelluli SW620 li jesprimu l-proteina tal-fużjoni dCas9/KRAB inkisbu permezz tat-trasduzzjoni tal-virus.Ċelloli SW620 modifikati ġew infettati bil-librerija tal-virus f'erba 'esperimenti ta' infezzjoni indipendenti f'MOI ta '0.1-0.3 u ttieħdu kampjuni b'2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) għal 2 ijiem.Minn hemm 'il quddiem, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​għal 18-il jum in vitro b'kopertura minima tal-librerija ta' 500 ċellula/sgRNA għall-iskrinjar.
Id-DNA ġenomika ġie estratt skont l-istruzzjonijiet tal-QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, il-Ġermanja; 51183).B'kollox, intużaw 100 μg ta 'DNA ġenomika għal kull ripetizzjoni bijoloġika biex tinbena l-librerija.Ir-reġjun sgRNA ġie amplifikat b'żewġ rawnds ta 'PCR u konness ma' barcode.
Il-prodotti tal-PCR ġew ippurifikati bl-użu ta 'ġel NucleoSpin® u kit ta' purifikazzjoni tal-PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, il-Ġermanja; 740609.250) u kkwantifikati bl-użu ta 'kit ta' detezzjoni tad-DNA double-stranded Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
L-assaġġ MTS intuża biex titkejjel il-proliferazzjoni taċ-ċelluli.Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi pjanċi ta '96 bir f'densità inizjali ta' 2000 ċellula/bir.In-numru relattiv ta 'ċelluli kien imkejjel kuljum fil-ħin indikat għal total ta' 4-6 ijiem.Għal kull bir, 20 μl ta 'reaġent MTS (Promega) ġie dilwit b'100 μl ta' DMEM, inkubat maċ-ċelloli għal 4 sigħat f'37 ° C, u mbagħad tkejjel OD490.
Il-kapaċità għal tkabbir mhux ankrat ġiet skoperta bl-analiżi tal-formazzjoni ta 'sferi.Fil-qosor, 2000 ċellula trasfettata b'shRNA DARS-AS1 jew shRNA ta 'kontroll ġew ikkultivati ​​f'microplates ta' twaħħil ultra baxx (Corning) b'bidla medja kull 4 ijiem.L-isferojdi ġew magħduda wara 14-il jum.500 ċellula trasfettata bil-plażmidu ta 'espressjoni żejda DARS-AS1 jew plażmid ta' kontroll intużaw għall-assaġġ ta 'titjib, inkella l-metodu ma nbidilx.
L-RNA ġie traskritt bl-użu ta 'T7 RNA polymerase u biotin-16-UTP (Roche 1138908910) skont l-istruzzjonijiet ta' Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Il-primers użati hawn huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 4.
Ir-reġjuni PACT jew PKR li jikkodifikaw il-proteini ġew ikklonati f'pET15b (Addgene #73619) u trasformati f'BL21(DE3).Il-batterji ġew inkubati matul il-lejl f'LB fornut b'ampicillin u mbagħad dilwit 100 darba b'LB frisk.Meta l-OD600 tal-medju laħaq 0.8, ġie miżjud 1 mM IPTG biex jinduċi l-espressjoni tal-proteini.Wara l-inkubazzjoni matul il-lejl bi tħawwad ġentili (250 rpm f'20 ° C), il-pellet taċ-ċelluli nġabar permezz ta 'ċentrifugazzjoni (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Isospendi mill-ġdid il-pellet taċ-ċelluli f'liżi buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) u inkuba fuq is-silġ għal 30 min, imbagħad issonika (15 min, 5 s mixgħul/mitfi, fuq is-silġ) u ċentrifuga (13,000). rpm)., 30 min, 4°С).Is-supernatant imbagħad ġie mgħobbi fuq reżina Ni-NTA (QIAGEN) 3 darbiet f'4°C, maħsul 4 darbiet bil-wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) u eluwit 3 darbiet, b'total ta' 10 ml buffer tal-eluwent (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Proteina purifikata ġiet iddeterminata bl-użu tal-WB u l-konċentrazzjoni ġiet determinata bl-użu tal-kit tal-assaġġ tal-proteini Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Assays RIP saru kif deskritt qabel, b'modifiki.Fil-qosor, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cocktail ċitostatiku 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) u ċentrifuga fi 13,000 rpm għal 15-il minuta f'4 °C.Is-supernatant imbagħad ġie inkubat bi żibeġ manjetiċi ta 'proteina A + G (Millipore) konjugat ma' 5 μg ta 'antikorp anti-PACT (Abeam) jew IgG (CST).Iż-żibeġ ġew maħsula 5 darbiet b'5x RIP buffer, imbagħad diġerit bi proteinase K (NEB).L-RNA ġie estratt bi Trizol u ddeterminat b'RT-qPCR.Primers huma ppreżentati fit-Tabella Supplimentari 5.
L-assaġġ RIP in vitro sar skont protokoll standard modifikat tal-assaġġ RIP.Total ta '5 pmol ta' RNA traskritt in vitro ġie dilwit 1x b'RIP buffer u ittemprat b'inkubazzjoni f'65 ° C għal 5 minuti segwiti minn tkessiħ bil-mod sa temperatura tal-kamra.Total ta' 5 pmol ta' proteini PACT ittikkettjati b'bandiera intatti jew mutati ġew ippurifikati minn E. coli.Inkuba b'RNA rinaturat għal sagħtejn f'4°C u segwi l-proċedura ta' hawn fuq għall-analiżi RIP għall-IP kontra l-bandiera.
Għall-analiżi tal-estensjoni tal-RNA, ċelluli 1 × 107 ġew lysed b'1xRIP buffer.Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'13,000 rpm għal 15-il minuta f'4 ° C, is-supernatant ġie trattat minn qabel bi 30 μl ta 'żibeġ manjetiċi streptavidin (Beckman) għal 2 sigħat f'4 ° C.Il-lisat purifikat imbagħad ġie fornut b'tRNA tal-ħmira u inkubat b'40 pmol ta 'RNA renaturat matul il-lejl f'4 ° C, imbagħad għal 2 sigħat oħra u ġew miżjuda 20 μl ta' żibeġ manjetiċi ġodda ta 'streptavidin imblukkati b'BSA.Il-pass tal-ħasil kien jikkonsisti f'4 darbiet b'5x RIP buffer u 4 darbiet b'1x RIP buffer.Il-proteini korrispondenti ġew elużi b'buffer ta 'eluzzjoni tal-bijotina (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) u sseparati fuq NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Wara t-tbajja tal-fidda (Beyotime Biotechnology), ċerti meded ġew imnaqqsa u analizzati mill-SM.
Twettqet analiżi Co-IP biex tittestja l-interazzjoni bejn PACT u PKR.Fil-qosor, lysates supernatant ġew ippreparati billi inkubaw 1 x 107 ċelluli lysed f'1 x RIP buffer segwit minn ċentrifugazzjoni f'13,000 rpm għal 15-il minuta f'4 ° C.Lysates kienu mgħobbija bi proteina A + G żibeġ manjetiċi, konjugati ma '5 µg ta' anti-PACT antikorp, u bil-mod imdawra matul il-lejl f'4 ° C.Iż-żibeġ ġew maħsula 3 darbiet b'5 × buffer RIP, darbtejn b'1 × buffer RIP u elużi b'1 × buffer SDS.Il-proteina rkuprata ġiet analizzata bil-ġel SDS-PAGE u misjuba minn WB.
Żewġ pmol ta' PACT immarkat u 1 pmol ta' PKR ġew ippurifikati minn E. coli.Iddilwixxi f'1 × RIP buffer u inkuba b'10 pmol ta' RNA renaturat għal sagħtejn f'4 °C.Wara dan, ġew inkubati b'antikorp anti-tikkettat biż-żibeġ manjetiku tal-proteina A + G għal sagħtejn addizzjonali.Iż-żibeġ imbagħad ġew maħsula erba 'darbiet b'1x RIP buffer u elużi b'1x SDS buffer.Il-PACT u PKR li jirriżultaw ġew misjuba minn WB.

Ħin tal-post: 23-Settembru 2022