English
  • page_banner

Aħbarijiet

Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Metodi ta 'tikkettar ta' prossimità enżimatika bbażati fuq esteri attivati ​​jew radikali fenossidi huma wżati ħafna biex jiġu mmappjati proteomi subċellulari u interatturi tal-proteini fiċ-ċelloli ħajjin.Madankollu, l-esteri attivati ​​huma inqas reattivi, li jirriżultaw f'raġġ ta 'tikkettar wiesa', u radikali fenossiċi ġġenerati mit-trattament tal-perossidu jistgħu jinterferixxu mal-mogħdijiet redox.Hawnhekk nirrapportaw metodu ta 'fotoattivazzjoni dipendenti fuq it-tikkettar tal-prossimità (PDPL) żviluppat billi torbot ġenetikament il-proteina fotosensibilizzatur miniSOG ma' proteina ta 'interess.Ixprunat minn dawl blu u kkontrollat ​​mill-ħin ta 'espożizzjoni, l-ossiġnu singlet huwa ġġenerat u mbagħad jinkiseb ittikkettjar spazjotemporalment solvut tar-residwi ta' histidine mis-sonda anilina.Aħna nuru l-fedeltà għolja tiegħu permezz ta 'mapping tal-proteome speċifiku għall-organelli.Tqabbil ġenb ma 'ġenb ta' PDPL ma 'TurboID juri kopertura proteomika aktar speċifika u komprensiva ta' PDPL.Sussegwentement, applikajna PDPL għall-koattivatur tat-traskrizzjoni assoċjat mal-marda BRD4 u E3 Parkin ligase u sibna interatturi mhux magħrufa qabel.Permezz ta 'screening ta' espressjoni żejda, żewġ sottostrati mhux magħrufa, Ssu72 u SNW1, ġew identifikati għal Parkin, li d-degradazzjoni tiegħu hija medjata mill-mogħdija ta 'ubiquitination-proteasome.
Karatterizzazzjoni preċiża tan-netwerks tal-proteini hija l-bażi ta 'ħafna proċessi ċellulari fundamentali.Għalhekk, l-immappjar spazjotemporali preċiż ħafna tal-interazzjonijiet tal-proteini se jipprovdi bażi molekulari għad-deċifrar tal-mogħdijiet bijoloġiċi, il-patoloġija tal-mard, u tfixkel dawn l-interazzjonijiet għal skopijiet terapewtiċi.Għal dan il-għan, metodi li kapaċi jiskopru interazzjonijiet temporali f'ċelloli jew tessuti ħajjin huma mixtieqa ħafna.L-Ispettrometrija tal-Massa tal-Purifikazzjoni tal-Affinità (AP-MS) storikament intużat biex jiġu identifikati msieħba li jorbtu ta' proteini ta' interess (POIs).Bl-iżvilupp ta 'metodi ta' proteomika kwantitattiva, inħoloq Bioplex3.0, l-akbar database ta 'netwerks ta' proteini bbażati fuq AP-MS.Għalkemm l-AP-MS huwa qawwi ħafna, il-passi taċ-ċelluli liżi u dilwizzjoni fil-fluss tax-xogħol huma preġudikati lejn interazzjonijiet ta 'rbit dgħajfa u temporanji u jintroduċu artifatti ta' wara l-liżi bħal pari ta 'interazzjoni spurju li m'għandhomx kompartimentalizzazzjoni qabel il-liżi.
Biex jiġu indirizzati dawn il-kwistjonijiet, ġew żviluppati aċidi amminiċi mhux naturali (UAA) b'gruppi ta' crosslinking u pjattaformi ta' tikkettjar fil-viċin enżimatiku (PL) (eż. APEX u BioID)5.Għalkemm il-metodu UAA ġie applikat b'suċċess f'ħafna xenarji u jipprovdi informazzjoni dwar adeżivi ta 'proteini diretti, l-ottimizzazzjoni tas-sit ta' inserzjoni UAA għadha meħtieġa.Aktar importanti minn hekk, huwa metodu ta 'tikkettar stejkjometriku li nieqes minn treġġigħ lura katalitiku ta' avvenimenti ta 'tikkettar.B'kuntrast, il-metodi PL enżimatiċi, bħall-metodu BioID, jingħaqdu l-biotin ligase inġinerija għal POI7, li sussegwentement jattiva l-bijotina biex jifforma intermedju reattiv biotinyl-AMP ester.L-enzima għalhekk tikkatalizza u tirrilaxxa "sħaba" tal-bijotina attivata li tikkettja r-residwi tal-lisina prossimali.Madankollu, il-BioID teħtieġ aktar minn 12-il siegħa biex tikseb sinjal tikkettat suffiċjenti, li jipprekludi l-użu tiegħu b'riżoluzzjoni temporali.Bl-użu ta 'evoluzzjoni diretta bbażata fuq il-wiri tal-ħmira, TurboID ġie ddisinjat ibbażat fuq BioID biex ikun aktar effiċjenti, li jippermetti tikkettjar effiċjenti b'bijotina fi żmien 10 minuti, li jippermetti li jiġu studjati proċessi aktar dinamiċi.Minħabba li TurboID huwa attiv ħafna u l-livelli ta 'bijotina endoġeni huma biżżejjed għal tikkettjar ta' livell baxx, it-tikkettjar fl-isfond isir problema potenzjali meta tikkettjar imtejjeb ħafna u f'waqtu huwa meħtieġ biż-żieda ta 'bijotina eżoġena.Barra minn hekk, l-esteri attivati ​​huma reattivi ħażin (t1/2 ~ 5 min), li jista 'jwassal għal raġġ ta' tikkettjar kbir, speċjalment wara saturazzjoni ta 'proteini ġirien b'bijotina 5. F'approċċ ieħor, fużjoni ġenetika ta 'inġinerija ta' ascorbate peroxidase (jiġifieri biotin- radikali fenol u jippermetti t-tikkettar tal-proteini fi żmien minuta 9, 10. APEX huwa użat ħafna biex jidentifika proteomi subċellulari, kumplessi ta 'proteini tal-membrana, u kumplessi ta' proteini ta 'sinjalazzjoni ċitosolika 11, 12. Madankollu, il-ħtieġa għal konċentrazzjonijiet għolja ta' perossidi tista 'taffettwa proteini jew mogħdijiet redox, li tfixkel proċessi ċellulari.
Għalhekk, metodu ġdid li kapaċi jiġġenera speċijiet ta 'soppressjoni ta' raġġ tikkettat aktar reattivi bi preċiżjoni spazjali u temporali għolja mingħajr ma jfixkel b'mod sinifikanti l-mogħdijiet ċellulari se jkun żieda importanti għall-metodi eżistenti. Fost l-ispeċi reattivi, l-ossiġnu singlet qajjem l-attenzjoni tagħna minħabba l-ħajja qasira tiegħu u r-raġġ ta 'diffużjoni limitat (t1/2 < 0.6 µs fiċ-ċelloli)13. Fost l-ispeċi reattivi, l-ossiġnu singlet qajjem l-attenzjoni tagħna minħabba l-ħajja qasira tiegħu u r-raġġ ta 'diffużjoni limitat (t1/2 < 0.6 µs fiċ-ċelloli)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Fost il-forom attivi, l-ossiġnu singlet ġibed l-attenzjoni tagħna minħabba l-ħajja qasira tiegħu u r-raġġ ta 'diffużjoni limitat (t1/2 < 0.6 µs fiċ-ċelloli)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs（三 1/2 < 0.6 µs（1 µs（ 1. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Fost il-forom attivi, l-ossiġnu singlet jiġbed l-attenzjoni tagħna minħabba l-ħajja qasira tiegħu u r-raġġ ta 'diffużjoni limitat (t1 / 2 < 0.6 μs fiċ-ċelloli).L-ossiġnu singlet ġie rrappurtat li jossidizza b'mod każwali methionine, tyrosine, histidine u tryptophan, li jagħmilha polari 14,15 għat-twaħħil ma 'sondi bbażati fuq amine jew thiol16,17.Għalkemm l-ossiġnu singlet intuża biex jittikketta l-RNA tal-kompartiment subċellulari, l-istrateġiji għar-ripurposing tal-markaturi tal-prossimità tal-POI endoġeni għadhom mhux esplorati.Hawnhekk, aħna nippreżentaw pjattaforma msejħa photoactivation-dipend proximity labeling (PDPL), fejn nużaw dawl blu biex iddawwal POIs mgħaqqda ma 'fotosensibilizzatur miniSOG u nixprunaw il-ġenerazzjoni ta' ossiġnu singlet biex jossidaw ir-residwi prossimali, segwit minn modifiki li fihom amine biex jossidaw sondi kimiċi f' ċelluli ħajjin intermedji..Aħna ttestjajna grupp ta 'sondi kimiċi biex timmassimizza l-ispeċifiċità tat-tikketta u identifikajna siti ta' modifika bl-użu ta 'fluss tax-xogħol tal-proteomics miftuħ.Tqabbil ġenb ma 'ġenb ta' PDPL ma 'TurboID juri kopertura proteomika aktar speċifika u komprensiva ta' PDPL.Aħna applikajna dan l-approċċ għal markaturi speċifiċi għall-organelli tal-proteome subċellulari u l-identifikazzjoni ġenerali tal-proteome ta’ sħab li jorbtu għall-proteina regolatorja epiġenetika assoċjata mal-kanċer BRD4 u l-E3 ligase Parkin assoċjata mal-marda ta’ Parkinson, li kkonfermaw kemm netwerk magħruf kif ukoll mhux magħruf ta’ proteini. interazzjonijiet..Il-kapaċità tal-PDPL li jirrikonoxxi sottostrati E3 f'kumplessi ta 'proteini kbar tirrappreżenta sitwazzjoni fejn ir-rikonoxximent ta' leganti indiretti huwa meħtieġ.Żewġ substrati tal-parkin mhux magħrufa medjati minn ubiquitination-proteasome ġew ikkonfermati in situ.
Terapija fotodinamika (PDT)19 u inattivazzjoni tal-laser assistita minn kromofori (CALI)20, li fiha l-irradjazzjoni tad-dawl b'fotosensibilizzanti tiġġenera ossiġnu singlet, jistgħu jinattivaw proteini fil-mira jew jikkawżaw mewt taċ-ċelluli.Peress li l-ossiġnu singlet huwa sustanza reattiva ħafna b'distanza ta 'diffużjoni teoretika ta' madwar 70 nm, tista 'tiġi kkontrollata ossidazzjoni limitata spazjalment madwar il-fotosensibilizzatur.Ibbażat fuq dan il-kunċett, iddeċidejna li nużaw l-ossiġnu singlet biex niksbu tikkettjar mill-qrib ta 'kumplessi ta' proteini fiċ-ċelloli ħajjin.Aħna żviluppajna approċċ kimoproteomiku PDPL biex twettaq erba 'funzjonijiet: (1) biex tikkatalizza l-ġenerazzjoni ta' ossiġnu singlet attiv simili għall-approċċ enżimatiku PL;(2) jipprovdu tikkettjar riżolt fil-ħin mal-bidu tad-dawl;(3) b'alterazzjoni (4) Evita li tuża kofatturi endoġeni (bħal bijotina) biex tnaqqas l-isfond, jew uża reaġenti eżoġeni li jfixklu ħafna (bħal perossidi) biex timminimizza l-espożizzjoni taċ-ċelluli għal stress ambjentali.
Fotosensitizers jistgħu jinqasmu f'żewġ kategoriji inklużi fluworofori ta' piż molekulari żgħir (eż. rose bengal, methylene blue)22 u proteini żgħar kodifikati ġenetikament (eż. miniSOG, KillerRed)23.Biex niksbu disinn modulari, żviluppajna l-pjattaforma PDPL tal-ewwel ġenerazzjoni billi żidna proteini fotosensibilizzanti (PS) mal-POI24,25 (Figura 1a).Meta irradjat b'dawl blu, l-ossiġnu singlet jossidizza residwi ta 'aċidu amminiku nukleofiliku prossimali, li jirriżulta f'polarità umpolung li hija elettrofilika u tista' tirreaġixxi aktar man-nukleofili tas-sonda amine16,17.Is-sonda hija ddisinjata b'manku tal-alkin biex tippermetti l-kimika tal-ikklikkja u tiġbed 'l isfel għal karatterizzazzjoni LC/MS/MS.
Illustrazzjoni skematika ta 'l-ittikkettjar ta' kumplessi ta 'proteini medjati minn miniSOG....Meta jkunu esposti għal dawl blu, iċ-ċelloli li jesprimu miniSOG-POI jiġġeneraw ossiġnu singlet, li jimmodifika proteini li jinteraġixxu iżda mhux proteini li ma jorbtux.Prodotti intermedji ta 'fotoossidazzjoni huma interċettati minn tikketti relay tas-sonda kimika amine biex jiffurmaw adducts kovalenti.Il-grupp alkynyl fuq is-sonda tal-kimika jippermetti li tikklikkja l-kimika għall-arrikkiment permezz ta' pull-down segwit minn kwantifikazzjoni LC-MS/MS.b Struttura kimika ta 'sondi amine 1-4.c Analiżi rappreżentattiva tal-ġel fluworexxenti ta 'markaturi proteomiċi medjati minn miniSOG lokalizzati mitokondrijali bl-użu ta' sondi 1-4 u kwantifikazzjoni relattiva bbażata fuq densitometrija tal-ġel.Il-proporzjon tas-sinjal għall-isfond ta 'sondi kimiċi ġie vvalutat bl-użu ta' esperimenti ta 'kontroll negattiv eskluż dawl blu jew bl-użu ta' ċelloli HEK293T mingħajr espressjoni miniSOG.n = 2 kampjuni bijoloġikament indipendenti.Kull tikka tirrappreżenta replika bijoloġika.d Sejbien u kwantifikazzjoni rappreżentattivi ta' PDPL bl-użu ta' sonda ottimizzata 3 fil-preżenza jew in-nuqqas tal-komponenti PDPL indikati bħal c.n = 3 kampjuni bijoloġikament indipendenti.Kull tikka tirrappreżenta replika bijoloġika.Il-linji taċ-ċentru u l-whiskers jirrappreżentaw il-medja u ± devjazzjoni standard.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Immaġini konfokali ta' ossiġnu singlet b'tebgħa Si-DMA ħamra bogħod.Skala bar: 10 µm.Immaġini tal-ġel u esperimenti konfokali ġew ripetuti b'mod indipendenti mill-inqas darbtejn b'riżultati simili.
L-ewwel ittestjajna l-abbiltà tal-fotosensitizers maturi miniSOG26 u KillerRed23, espressi b'mod stabbli f'HEK293T, li jimmedjaw it-tikkettar tal-propargylamine tal-proteome bħala sonda kimika (Fig. 1a Supplimentari).L-analiżi tal-fluworexxenza tal-ġel uriet li t-tikkettar tal-proteome kollu nkiseb bl-użu ta 'miniSOG u irradjazzjoni tad-dawl blu, filwaqt li ma ġie osservat l-ebda prodott ta' tikkettjar viżibbli b'KillerRed.Biex intejbu l-proporzjon tas-sinjal għall-isfond, aħna mbagħad ittestjaw sett ta 'sondi kimiċi li fihom anilina (1 u 3), propilamina (2), jew benżilamina (4).Aħna osservajna li ċ-ċelloli HEK293T nfushom kellhom sinjal ta 'sfond ogħla meta mqabbel ma' l-ebda dawl blu, possibilment minħabba l-fotosensibilizzatur riboflavin endoġenu, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Sondi kimiċi bbażati fuq l-anilina 1 u 3 taw speċifiċità aħjar, b'HEK293T jesprimi b'mod stabbli miniSOG fil-mitokondrija li juri żieda ta '> 8 darbiet fis-sinjal għas-sonda 3, filwaqt li s-sonda 2 użata fil-metodu ta' tikkettjar RNA CAP-seq juri biss ~ 2.5- żieda tas-sinjal darbiet, x'aktarx minħabba preferenzi ta 'reattività differenti bejn RNA u proteina (Fig. 1b, c). Sondi kimiċi bbażati fuq l-anilina 1 u 3 taw speċifiċità aħjar, b'HEK293T jesprimi b'mod stabbli miniSOG fil-mitokondrija li juri żieda ta '> 8 darbiet fis-sinjal għas-sonda 3, filwaqt li s-sonda 2 użata fil-metodu ta' tikkettjar RNA CAP-seq juri biss ~ 2.5- żieda tas-sinjal darbiet, x'aktarx minħabba preferenzi ta 'reattività differenti bejn RNA u proteina (Fig. 1b, c).Sondi kimiċi bbażati fuq l-anilina 1 u 3 wrew speċifiċità aħjar: HEK293T, li jesprimi b'mod stabbli miniSOG fil-mitokondrija, juri aktar minn żieda ta '8 darbiet fis-sinjal għas-sonda 3, filwaqt li s-sonda 2, użata fil-metodu ta' tikkettjar RNA CAP-seq, biss juri żieda tas-sinjal ta '~2.5 darbiet, probabbilment minħabba preferenzi ta' reattività differenti bejn RNA u proteina (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 线 粒体 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 ， 而 用 于 RNA 标记 方法 cap-seq 的 2 仅 显示 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， ， hek293t 在 粒体 中 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 cap-Eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAIs-sondi kimiċi bbażati fuq l-anilina 1 u 3 kellhom speċifiċità aħjar, HEK293T esprimew b'mod stabbli miniSOG fil-mitokondrija, u s-sonda 3 kellha żieda ta 'aktar minn 8 darbiet fis-sinjal, filwaqt li s-sonda 2 għall-metodu ta' tikkettjar RNA CAP-seq wriet biss żieda ta '~2.5 darbiet.fis-sinjal, probabbilment minħabba preferenzi ta 'reazzjoni differenti bejn RNA u proteina (Fig. 1b, c).Barra minn hekk, ġew ittestjati l-isomeri tas-sonda 3 u s-sondi tal-idrażina (sondi 5, 6, 7), li kkonfermaw l-ottimizzazzjoni tas-sonda 3 (Fig. Supplimentari 1b, c).Bl-istess mod, l-analiżi tal-fluworexxenza fil-ġell żvelat parametri sperimentali ottimizzati oħra: tul ta 'mewġ ta' irradjazzjoni (460 nm), konċentrazzjoni ta 'sonda kimika (1 mM) u ħin ta' irradjazzjoni (20 min) (Fig. Supplimentari 2a-c).Li tħalli barra kwalunkwe komponent jew pass fil-protokoll PDPL irriżulta f'treġġigħ lura sinifikanti tas-sinjal għall-isfond (Fig. 1d).Notevolment, it-tikkettjar tal-proteini kien imnaqqas b'mod sinifikanti fil-preżenza ta 'sodium azide jew trolox, li huma magħrufa li jaqtgħu l-ossiġnu singlet.Il-preżenza ta 'D2O, li hija magħrufa li tistabbilizza l-ossiġnu singlet, ittejjeb is-sinjal tat-tikkettar.Biex tinvestiga l-kontribut ta 'speċi oħra ta' ossiġnu reattiv għall-ittikkettjar, ġew miżjuda mannitol u vitamina Ċ biex jistabbilixxu kenniesi radikali hydroxyl u superoxide, rispettivament, 18, 29, iżda ma nstabux li jnaqqsu l-ittikkettar.Iż-żieda ta 'H2O2, iżda mhux illuminazzjoni, ma rriżultatx f'tikkettar (Figura Supplimentari 3a).L-immaġini ta 'l-ossiġnu singlet tal-fluworexxenza b'sondi Si-DMA kkonfermaw il-preżenza ta' ossiġnu singlet fil-wajer HEK293T-miniSOG, iżda mhux fil-wajer HEK293T oriġinali.Barra minn hekk, mitoSOX Red ma setgħetx tiskopri l-produzzjoni ta 'superossidu wara l-illuminazzjoni (Fig. 1e u Fig. 3b Supplimentari) 30. Din id-dejta tissuġġerixxi bil-qawwa li l-ossiġnu singlet huwa l-ispeċi prinċipali ta 'ossiġnu reattiv responsabbli għat-tikkettar proteomic sussegwenti.Iċ-ċitotossiċità tal-PDPL ġiet evalwata inkluża l-irradjazzjoni tad-dawl blu u sondi kimiċi, u ma ġiet osservata l-ebda ċitotossiċità sinifikanti (Fig. 4a Supplimentari).
Sabiex nistudjaw il-mekkaniżmu tat-tikkettar u nippermettu l-identifikazzjoni proteomika ta 'kumplessi ta' proteini bl-użu ta 'LC-MS/MS, l-ewwel għandna bżonn niddeterminaw liema aċidi amminiċi huma modifikati u l-massa delta tat-tikketti tas-sonda.Methionine, histidine, tryptophan u tyrosine ġew irrappurtati li ġew modifikati bl-ossiġnu singlet14,15.Aħna nintegraw il-fluss tax-xogħol TOP-ABPP31 mat-tfittxija miftuħa imparzjali pprovduta mill-pjattaforma tal-kompjuters FragPipe ibbażata fuq MSFragger32.Wara l-modifika tal-ossiġnu singlet u t-tikkettar tas-sonda kimika, il-kimika tal-ikklikkja saret bl-użu ta 'tikketta ta' tnaqqis tal-bijotina li fiha linker li jista 'jinqasam, segwit minn tiġbid ta' neutravidin u diġestjoni tat-trypsin.Il-peptide modifikat, li għadu marbut mar-reżina, ġie fotocleaved għall-analiżi LC-MS/MS (Figura 2a u Dejta Supplimentari 1).Numru kbir ta 'modifiki seħħew matul il-proteome b'aktar minn 50 peptide map (PSM) logħbiet elenkati (Fig. 2b).B'mod sorprendenti, osservajna biss modifika ta 'histidine, probabbilment minħabba r-reattività ogħla ta' histidine ossidizzat lejn sondi anilina minn aċidi amminiċi oħra.Skont il-mekkaniżmu ppubblikat tal-ossidazzjoni tal-histidine bl-ossiġnu singlet,21,33 l-istruttura proposta tal-delta-massa ta' + 229 Da tikkorrispondi għall-adduct tas-sonda 3 b'2-oxo-histidine wara żewġ ossidazzjonijiet, filwaqt li + 247 Da huwa l-prodott tal-idroliżi ta' + 229 Da (Fig. 5 Supplimentari).L-evalwazzjoni tal-ispettru MS2 wriet affidabilità għolja ta 'identifikazzjoni tal-biċċa l-kbira tal-joni y u b, inkluża l-identifikazzjoni ta' joni framment modifikati (y u b) (Fig. 2c).L-analiżi tal-kuntest tas-sekwenza lokali ta 'histidini modifikati bil-PDPL żvelat preferenza moderata ta' motif għal residwi idrofobiċi żgħar f'pożizzjonijiet ± 1 (Fig. 4b Supplimentari).Bħala medja, ġew identifikati 1.4 histidines għal kull proteina, u s-siti ta 'dawn il-markaturi ġew determinati b'analiżi tal-wiċċ aċċessibbli tas-solvent (SASA) u tad-disponibbiltà relattiva tas-solvent (RSA) (Fig. Supplimentari 4c, d).
Fluss tax-xogħol imparzjali għall-istudju tas-selettività residwa bl-użu tal-pjattaforma tal-kompjuters FragPipe mħaddma minn MSFragger.Linkers li jistgħu jinqasmu huma wżati fil-kimika Ikklikkja biex jippermettu fotoqsim ta 'peptidi modifikati mir-reżina streptavidin.Tnediet tfittxija miftuħa biex jiġu identifikati bosta modifiki, kif ukoll fdalijiet rilevanti.b Assenja l-massa tal-modifiki li jseħħu madwar il-proteome.L-immappjar tal-peptidi PSM.c Annotazzjoni spettrali MS2 tas-siti histidine modifikati bis-sonda 3. Bħala eżempju rappreżentattiv, reazzjoni kovalenti mas-sonda 3 żiedet +229.0938 Da mal-aċidu amminiku modifikat.d Assaġġ ta' mutazzjoni użat biex jiġi ttestjat għal markaturi PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) u PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ġew trasfettati bi plasmidi tat-tip selvaġġ għal skoperta kontra l-Bandiera.e Il-peptide sintetiku ġie reazzjoni b'miniSOG purifikat fil-preżenza tas-sonda 3 u l-prodotti korrispondenti b'Δm +247 u +229 ġew innutati fl-ispettru LC-MS.f Interazzjonijiet in vitro bejn proteini u proteini mmudellati b'miniSOG-6xHis-tag u antikorp anti-6xHis.Analiżi ta 'antibijotin (streptavidin-HRP) u Western blot kontra l-ġurdien ta' kumplessi ta 'antikorpi miniSOG-6xHis/anti-6xHis ittikkettati b'sonda 3, skont il-ħin ta' espożizzjoni għad-dawl.It-tikketti għall-proteini individwali huma espressi fil-piż molekulari korrispondenti: katina ħafifa tal-antikorpi LC, katina tqila tal-antikorpi HC.Dawn l-esperimenti ġew ripetuti b'mod indipendenti mill-inqas darbtejn b'riżultati simili.
Għall-verifika bijokimika tas-sit tat-tikkettar, PRDX3 u PRDX1 identifikati mill-ispettrometrija tal-massa nbidlu minn histidine għal alanine u mqabbla ma 'tip selvaġġ f'assaġġi ta' trasfezzjoni.Ir-riżultati tal-PDPL wrew li l-mutazzjoni naqqset it-tikkettar b'mod sinifikanti (Fig. 2d).Sadanittant, is-sekwenzi tal-peptidi identifikati fit-tfittxija miftuħa ġew sintetizzati u rreaġixxew in vitro b'miniSOG purifikat fil-preżenza ta 'sonda 3 u dawl blu, li jipproduċu prodotti b'ċaqliq tal-massa ta' + 247 u + 229 Da meta skoperti minn LC-MS (Fig. . 2e).).Biex tittestja jekk il-proteini prossimali interazzjoni jistgħux jiġu ttikkettjati in vitro b'reazzjoni għal fotoattivazzjoni miniSOG, iddisinjajna assaġġ ta 'prossimità artifiċjali b'interazzjoni bejn il-proteina miniSOG-6xHis u antikorp monoklonali anti-His in vitro (Figura 2f).F'dan l-assaġġ, konna nistennew tikkettar prossimali ta 'ktajjen tqal u ħfief ta' antikorpi b'miniSOG.Fil-fatt, kontra l-ġurdien (li jagħrfu l-ktajjen tqal u ħfief ta 'antikorp tikkettat anti-6xHis) u streptavidin Western blots wrew bijotinilazzjoni qawwija tal-ktajjen tqal u ħfief.Notevolment, innutajna l-awtobijotinilazzjoni tal-miniSOG minħabba t-tikketta 6xHis u l-cross-links bejn il-ktajjen ħfief u tqal, li jistgħu jkunu relatati mad-distakk deskritt qabel bejn ir-rispons prossimali tal-lysine u 2-oxo-histidine.Bħala konklużjoni, nikkonkludu li PDPL jimmodifika histidine b'mod dipendenti mill-prossimità.
L-għan li jmiss tagħna kien li nikkaratterizzaw il-proteome subċellulari biex tittestja l-ispeċifiċità tat-tikkettar in situ.Għalhekk, esprimejna b'mod stabbli miniSOG fin-nukleu, fil-matriċi mitokondrijali jew fil-membrana ER ta 'barra taċ-ċelloli HEK293T (Fig. 3a).L-analiżi tal-fluworexxenza tal-ġel uriet faxex ittikkettjati abbundanti fi tliet postijiet subċellulari kif ukoll mudelli ta 'tikkettjar differenti (Fig. 3b).L-analiżi tal-immaġini tal-fluworexxenza wriet speċifiċità għolja ta 'PDPL (Fig. 3c).Il-fluss tax-xogħol tal-PDPL kien segwit minn reazzjonijiet tal-ikklikkja b'żebgħat tar-rhodamine biex jiddelineaw proteomes subċellulari bl-użu ta 'mikroskopija fluworexxenti, u s-sinjali PDPL ġew colocalized ma' DAPI, trackers mitokondrijali, jew trackers ER, li jikkonfermaw il-fedeltà għolja ta 'PDPL.Għat-tliet postijiet tal-organelli, paragun ġenb ma 'ġenb ta' PDPL ma 'TurboID bl-użu ta' avidin western blot wera li PDPL kien ittikkettat b'mod aktar speċifiku meta mqabbel mal-kontrolli rispettivi tagħhom.Taħt kundizzjonijiet PDPL, dehru aktar meded tikkettati, li jindikaw aktar proteini tikkettati PDPL (Fig. Supplimentari 6a-d).
a Rappreżentazzjoni skematika tat-tikkettjar tal-proteome speċifiku għall-organelli medjat minn miniSOG.miniSOG jimmira l-matriċi mitokondrijali permezz ta’ fużjoni mat-23 aċidu amminiku N-terminal ta’ COX4 uman (mito-miniSOG), in-nukleu permezz ta’ fużjoni għal H2B (nukleu-miniSOG), u Sec61β permezz tan-naħa ċitoplasmika tal-membrana ER (ER-miniSOG). ).L-indikazzjonijiet jinkludu immaġini tal-ġel, immaġini konfokali, u spettrometrija tal-massa.b Immaġini tal-ġel rappreżentattivi ta 'tliet profili PDPL speċifiċi għall-organelli.CBB Coomassie Blu Brilliant.c Immaġini konfokali rappreżentattivi ta 'ċelloli HEK293T li jesprimu b'mod stabbli miniSOG b'lokalizzazzjonijiet subċellulari differenti misjuba minn antikorp ittikkettat V5 (aħmar).Markers subċellulari huma użati għall-mitokondrija u ER (aħdar).Il-fluss tax-xogħol PDPL jinkludi l-iskoperta ta 'proteomes subċellulari ttikkettjati miniSOG (isfar) bl-użu tal-kimika tal-ikklikkjar Cy3-azide.Skala bar: 10 µm.d Plottijiet vulkaniċi ta 'proteomes b'tikketta PDPL f'diversi organelli kkwantifikati bi kwantifikazzjoni mhux tikkettata (n = 3 esperimenti bijoloġiċi indipendenti).It-test t tal-Istudent b'żewġ denbu ntuża fuq plots tal-vulkan.Tip selvaġġ HEK293T intuża bħala kontroll negattiv. Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u> differenza fl-intensità tal-jone 2 darbiet). Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u> differenza fl-intensità tal-jone 2 darbiet). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосви интесо). Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u > 2 darbiet differenza fl-intensità tal-joni).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в исница в ионлной). Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u> differenza ta' darbtejn fis-saħħa jonika).Proteini relatati importanti għal HEK293T-miniSOG iżda mhux importanti għal HEK293T huma murija bl-aħdar.e Analiżi ta' l-ispeċifiċità ta' settijiet ta' data proteomiċi minn esperimenti d.In-numru totali ta 'proteini statistikament sinifikanti f'kull organelle (tikek ħomor u ħodor) huwa mmarkat fin-naħa ta' fuq.L-istogrammi juru proteini lokalizzati f'organelli bbażati fuq MitoCarta 3.0, analiżi GO u A. Ting et al.nies.Settijiet ta' dejta separati għal mitokondrija, nuklei, u ER.Dawn l-esperimenti ġew ripetuti b'mod indipendenti mill-inqas darbtejn b'riżultati simili.Id-dejta mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta' fajls ta' dejta mhux ipproċessata.
Imħeġġa mir-riżultati tal-ġel u tal-immaġini, intużat kwantifikazzjoni mingħajr tikketta biex tikkwantifika l-proteome identifikat f'kull organelle (Data Supplimentari 2).HEK293T mhux trasfettat intuża bħala kontroll negattiv biex jitnaqqsu l-markers tal-isfond. L-analiżi tal-plott tal-vulkan uriet proteini arrikkit b'mod sinifikanti (p <0.05 u> intensità tal-jone 2 darbiet) kif ukoll proteini singleton li huma preżenti biss f'linji li jesprimu miniSOG (Fig. 3d tikek ħomor u ħodor). L-analiżi tal-plott tal-vulkan uriet proteini arrikkit b'mod sinifikanti (p <0.05 u> intensità tal-jone 2 darbiet) kif ukoll proteini singleton li huma preżenti biss f'linji li jesprimu miniSOG (Fig. 3d tikek ħomor u ħodor). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). L-analiżi tal-plott tal-vulkan wriet proteini arrikkit b'mod sinifikanti (p<0.05 u> intensità tal-jone 2 darbiet) kif ukoll proteini singoli li huma preżenti biss f'linji li jesprimu miniSOG (Fig. 3d, tikek ħomor u ħodor).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). L-analiżi tal-plott tal-vulkan żvelat proteini arrikkit b'mod sinifikanti (p<0.05 u> 2x qawwa jonika) kif ukoll proteini singoli preżenti biss fil-linja ta 'espressjoni miniSOG (tikek ħomor u ħodor fil-Fig. 3d).Meta tgħaqqad din id-dejta, identifikajna 1364, 461, u 911 proteini tal-membrana ta 'barra nukleari, mitokondrijali u ER statistikament sinifikanti, rispettivament.Biex tanalizza l-eżattezza tal-PDPL lokalizzat bl-organelli, użajna MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analysis, u A. Ting et al.intuża data set8 għal mitokondrija, nukleu u ER biex tittestja l-ispeċifiċità tal-organelle tal-proteini misjuba, li tikkorrispondi għal preċiżjoni ta '73.4, 78.5, u 73.0% (Fig. 3e).L-ispeċifiċità tal-PDPL tikkonferma li l-PDPL huwa għodda ideali għall-identifikazzjoni tal-proteomi speċifiċi għall-organelli.Notevolment, l-analiżi sottomitokondrijali ta 'proteini mitokondrijali identifikati wriet li l-proteome maqbuda kien imqassam prinċipalment fil-matriċi u l-membrana ta' ġewwa (226 u 106, rispettivament), li jammontaw għal 91.7% (362) tan-numru totali ta 'proteini mitokondrijali identifikati.livell għoli ta 'PDPL ġie kkonfermat addizzjonalment (Figura Supplimentari 7a).Bl-istess mod, l-analiżi subnukleari wriet li l-proteome maqbud kien imqassam prinċipalment fin-nukleu, in-nukleoplasma u n-nukleolu (Fig. 7b Supplimentari).Analiżi proteomika nukleari b'peptide ta 'sinjal ta' lokalizzazzjoni nukleari (3xNLS) uriet preċiżjoni simili għall-kostruzzjoni H2B (Fig. Supplimentari 7c–h).Biex tiddetermina l-ispeċifiċità tal-markatur PDPL, il-laminin nukleari A ntgħażlet bħala nassa POI7 lokalizzata b'mod aktar diskret.PDPL identifika 36 proteina arrikkita b'mod sinifikanti, li minnhom 12-il proteina (30.0% inkluża lamin A) kienu proteini interazzjoni lamin A kkaratterizzati tajjeb annotati mid-database String, b'perċentwal ogħla mill-metodu BioID (122 proteini) 28 ta '28. , 22.9 %) 7. Il-metodu tagħna identifika inqas proteini, possibbilment minħabba żoni limitati ta 'tikkettar, li sar possibbli permezz ta' ossiġnu singlet aktar attiv.L-analiżi GO wriet li l-proteini identifikati kienu prinċipalment jinsabu fin-nukleoplasma (26), membrana nukleari (10), membrana nukleari (9), u pori nukleari (5).B'mod kollettiv, dawn il-proteini lokalizzati nukleari ammontaw għal 80% tal-proteini arrikkit, u wrew aktar l-ispeċifiċità tal-PDPL (Figura Supplimentari 8a–d).
Wara li stabbilixxa l-kapaċità tal-PDPL li jwettaq l-immarkar tal-prossimità fl-organelli, aħna mbagħad ittestjaw jekk il-PDPL jistax jintuża biex janalizza l-imsieħba li jorbtu POI.B'mod partikolari, fittxejna li niddefinixxu l-analiżi PDPL ta 'proteini ċitosoliċi, li huma kkunsidrati miri aktar diffiċli mill-kontropartijiet lokalizzati fil-membrana tagħhom minħabba n-natura dinamika ħafna tagħhom.Il-proteina bromodomain u extraterminal (BET) BRD4 ġibdet l-attenzjoni tagħna għar-rwol ewlieni tagħha f'diversi mard 35, 36.Il-kumpless iffurmat minn BRD4 huwa koattivatur tat-traskrizzjoni u mira terapewtika importanti.Billi tirregola l-espressjoni ta 'fatturi ta' traskrizzjoni c-myc u Wnt5a, BRD4 huwa maħsub li huwa determinant ewlieni ta 'lewkimja majelojde akuta (AML), majeloma multipla, limfoma ta' Burkitt, kanċer tal-kolon u mard infjammatorju37,38.Barra minn hekk, xi viruses jimmiraw lil BRD4 biex jirregolaw it-traskrizzjoni virali u ċellulari, bħal papillomavirus, HIV, u SARS-CoV-236,39.
Biex timmappja l-interazzjoni BRD4 bl-użu ta 'PDPL, aħna kkombinajna miniSOG ma' isoforma qasira N- jew C-terminal ta 'BRD4.Ir-riżultati proteomiċi żvelaw grad għoli ta 'koinċidenza bejn iż-żewġ kostruzzjonijiet (Fig. 9a Supplimentari).Il-proteome nukleari identifikat ma 'miniSOG-H2B ikopri 77.6% tal-proteini li jinteraġixxu ma' BRD4 (Fig. 9b Supplimentari).Imbagħad, intużaw ħinijiet differenti ta 'illuminazzjoni (2, 5, 10, 20 min) biex jaġġustaw ir-raġġ tal-markatur (Fig. 4a u data supplimentari 3).Aħna nikkonkludu li f'fotoperijodi iqsar, PDPL primarjament se tikkettja sħab diretti vinkolanti, filwaqt li perjodi itwal se jinkludu proteini identifikati matul perjodi iqsar ta 'fotoattivazzjoni kif ukoll miri indiretti f'kumplessi ta' tikkettjar.Fil-fatt, sibna koinċidenza qawwija bejn punti ta 'ħin adjaċenti (84.6% għal 2 u 5 min; 87.7% għal 5 u 10 min; 98.7% għal 10 u 20 min) (Fig. 4b u Supplimentari Fig. 9c).Fil-gruppi sperimentali kollha, sibna mhux biss BRD4 awto-tikkettar, iżda diversi miri magħrufa bħal MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, u HMGB1 annotati fid-database tal-istring.Is-saħħa jonika ta 'dawn il-miri hija proporzjonali għall-ħin ta' espożizzjoni (Fig. 4c u Fig. Supplimentari 9d).L-analiżi GO tal-proteini identifikati fil-grupp ta '2 minuti wriet li l-proteini identifikati kienu lokalizzati fin-nukleu u kienu involuti fir-rimodelizzazzjoni tal-kromatin u l-funzjoni tal-RNA polymerase.Il-funzjoni molekulari tal-proteina ġiet arrikkita fl-irbit tal-kromatina jew koattivazzjoni tat-traskrizzjoni, konsistenti mal-funzjoni BRD4 (Fig. 4d).L-analiżi tal-interazzjoni tal-proteini ppermettiet mid-database tal-istring żvelat l-ewwel livell ta’ interazzjonijiet indiretti bejn il-kumplessi ta’ interazzjoni tal-familja BRD4 u HDAC bħal SIN3A, NCOR2, BCOR, u SAP130 (Fig. 4e u Fig. ..Barra minn hekk, miri rappreżentattivi identifikati minn LC-MS/MS, inklużi Sin3A, NSUN2, Fus, u SFPQ, ġew ikkonfermati minn Western blotting (Fig. 4f).Riċentement, l-isoforma qasira ta 'BRD4 ġiet irrappurtata li tifforma nuklei bi proprjetajiet ta' separazzjoni tal-fażi likwidu-likwidu (LLPS).Il-proteini li jorbtu RNA Fus u SFPQ jimmedjaw l-LLPS ta 'diversi proċessi ċellulari u ġew identifikati hawn bħala proteini li jorbtu BRD4 mhux irreġistrati.L-interazzjoni bejn BRD4 u SFPQ ġiet ikkonfermata minn esperimenti ta 'ko-immunopreċipitazzjoni (ko-IP) (Figura 4g), li tissuġġerixxi mekkaniżmu ieħor għal separazzjoni tal-fażi likwidu-likwidu medjata minn BRD4 li jistħoqqilhom aktar investigazzjoni.Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li PDPL huwa pjattaforma ideali għall-identifikazzjoni ta 'BRD4 magħrufa li jinteraġixxu kif ukoll proteini li jorbtu mhux magħrufa.
a Rappreżentazzjoni skematika tal-immarkar tal-prossimità BRD4 medjat minn miniSOG, ħinijiet ta' espożizzjoni: 2, 5, 10, u 20 min.b Koinċidenza ta' proteini identifikati f'ħinijiet ta' illuminazzjoni differenti.L-arrikkiment tal-proteini identifikat f'HEK293T-miniSOG-BRD4 kien statistikament sinifikanti meta mqabbel ma 'HEK293T tat-tip selvaġġ.c Intensità tal-joni meta jiġu kkwantifikati proteini magħrufa li jgħaqqdu BRD4 rappreżentattivi mhux tikkettati matul iż-żmien speċifikat ta' espożizzjoni.n = 3 kampjuni bijoloġikament indipendenti.Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± devjazzjoni standard.d Analiżi ontoloġika tal-ġeni (GO) ta 'proteini identifikati fil-grupp ta' 2 minuti.L-ewwel għaxar termini GO huma elenkati.Il-bżieżaq huma kkuluriti skont il-kategorija tat-terminu GO, u d-daqs tal-bżieżaq huwa proporzjonali għan-numru ta 'proteini misjuba f'kull terminu.e Analiżi tal-istring ta' proteini li jinteraġixxu ma' BRD4.Iċ-ċrieki isfar huma kolla diretta u ċ-ċrieki griżi huma l-ewwel saff ta 'kolla indiretta.Il-linji ħomor jirrappreżentaw l-interazzjonijiet determinati b'mod sperimentali u l-linji blu jirrappreżentaw l-interazzjonijiet imbassra.f Miri li jorbtu BRD4 rappreżentattivi identifikati f'LC-MS/MS ġew ivverifikati permezz ta' Western blotting.g Esperimenti ta' ko-immunopreċipitazzjoni jikkonfermaw l-interazzjoni bejn SFPQ u BRD4.Dawn l-esperimenti ġew ripetuti b'mod indipendenti mill-inqas darbtejn b'riżultati simili.Id-dejta mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta' fajls ta' dejta mhux ipproċessata.
Minbarra l-identifikazzjoni ta 'miri assoċjati ma' POI mhux reġistrati, aħna ipoteżi li l-PDPL se jkun adattat għall-identifikazzjoni ta 'sottostrati għal enzimi, li jkunu jeħtieġu l-karatterizzazzjoni ta' proteini li jorbtu indirettament f'kumplessi kbar biex jiġu annotati sottostrati mhux irreġistrati.Parkin (kodifikat minn PARK2) huwa E3 ligase u mutazzjonijiet fil-parkin huma magħrufa li jikkawżaw il-marda ta' Parkinson taż-żgħażagħ awtosomali reċessiva (AR-JP)42.Barra minn hekk, il-parkin ġie deskritt bħala essenzjali għall-mitofaġija (awtofaġija mitokondrijali) u t-tneħħija ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv.Madankollu, għalkemm ġew identifikati diversi sottostrati tal-parkin, ir-rwol tal-parkin f'din il-marda għadu mhux ċar.Biex tinnota s-sottostrati mhux ikkaratterizzati tagħha, PDPL ġie ttestjat billi żied il-miniSOG mat-tmiem N- jew C-terminal tal-parkin.Iċ-ċelloli ġew ittrattati bit-trasportatur tal-proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) biex jattiva l-parkin permezz tal-passaġġ PINK1-Parkin.Meta mqabbla mar-riżultati tal-BRD4 PDPL tagħna, il-fużjoni tal-parkin N-terminus żvelat sett akbar ta 'proteini fil-mira, għalkemm kopriet porzjon akbar tat-terminal C (177 minn 210) (Figura 5a, b u Dejta Supplimentari 4).ir-riżultat huwa konsistenti mar-rapporti li tags N-terminali jistgħu jattivaw Parkin44 b'mod aberranti.B'mod sorprendenti, kien hemm biss 18-il proteina li jikkoinċidu fid-dejta tagħna b'riżultati AP-MS ippubblikati għal Parkin43, x'aktarx minħabba differenzi bejn il-linji taċ-ċelluli u l-flussi tax-xogħol tal-proteomika.Minbarra erba 'proteini magħrufa (ARDM1, HSPA8, PSMD14, u PSMC3) identifikati b'żewġ metodi (Fig. 5c)43.Biex jiġu vvalidati aktar ir-riżultati ta 'LC-MS/MS, trattament PDPL u Western blotting sussegwenti intużaw biex iqabblu r-riżultati tal-assaġġ taċ-ċellula ġenitur HEK293T u l-linja tal-parkin N-terminal stabbli.Miri mhux magħrufa qabel CDK2, DUT, CTBP1, u PSMC4 ġew ittestjati b'binder magħruf, DNAJB1 (Fig. 5d).
Plott tal-vulkan ta 'proteini li jinteraġixxu mal-parkin fiċ-ċelloli HEK293T b'miniSOG espressi b'mod stabbli mdewba mal-N- jew C-terminal tal-parkin (n = 3 esperimenti bijoloġiċi indipendenti).It-test t tal-Istudent b'żewġ denbu ntuża fuq plots tal-vulkan.HEK293T intuża bħala kontroll negattiv. Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u> differenza fl-intensità tal-jone 2 darbiet). Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u> differenza fl-intensità tal-jone 2 darbiet). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосви интесо). Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u > 2 darbiet differenza fl-intensità tal-joni).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в исница в ионлной). Proteini mibdula b'mod sinifikanti huma enfasizzati bl-aħmar (p < 0.05 u> differenza ta' darbtejn fis-saħħa jonika).Proteini relatati importanti għal HEK293T-miniSOG iżda mhux importanti għal HEK293T huma murija bl-aħdar.b Dijagramma ta' Venn li turi proteini li jikkoinċidu bejn N-terminal u C-terminal constructs.It-tikketti N-terminali jistgħu jattivaw il-parkin b'mod aberranti u jirriżultaw fi proteini aktar rikonoxxibbli.c Dijagramma Venn li turi proteini li jikkoinċidu bejn PDPL u AP-MS.Interatturi magħrufa huma elenkati, inklużi 4 minn 18-il proteina li jikkoinċidu u 11 minn 159 proteina identifikati speċifikament fil-PDPL.d Il-miri rappreżentattivi identifikati minn LC-MS/MS ġew ivverifikati minn Western blotting.e Ssu72 u SNW1 ġew identifikati bħala sottostrati tal-parkin mhux irreġistrati.Dawn il-plażmidi tal-proteini b'tagged FLAG ġew trasfettati f'HEK293T u HEK293T-Parkin-miniSOG segwiti minn trattament CCCP f'diversi punti ta 'żmien.Id-degradazzjoni kienet aktar evidenti fil-linja ta 'espressjoni żejda ta' Parkin.f Bl-użu tal-inibitur tal-proteasome MG132, ġie kkonfermat li l-proċess ta 'degradazzjoni ta' Ssu72 u SNW1 huwa medjat minn proteasome-ubiquitination.Dawn l-esperimenti ġew ripetuti b'mod indipendenti mill-inqas darbtejn b'riżultati simili.Id-dejta mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta' fajls ta' dejta mhux ipproċessata.
Notevolment, il-proteini identifikati mill-PDPL għandhom jinkludu proteini li jorbtu lill-parkin u s-sottostrati tagħhom.Biex tiskopri sottostrati ta 'parkin mhux irreġistrati, għażilna seba' proteini identifikati (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 u SNW1) u plasmidi trasfettati biex jesponu dawn il-ġeni għal HEK293T normali u jesprimu b'mod stabbli miniSOG-Parkin's HEK293T segwit minn trattament CCCP.Il-livelli ta 'proteini Ssu72 u SNW1 tnaqqsu b'mod sinifikanti fil-linja stabbli miniSOG-Parkin (Fig. 5e).It-trattament b'CCCP għal 12-il siegħa rriżulta fl-aktar degradazzjoni sinifikanti taż-żewġ sottostrati.Biex tinvestiga jekk id-degradazzjoni ta 'Ssu72 u SNW1 hijiex regolata minn proteasome-ubiquitination, l-inibitur tal-proteasome MG132 ġie miżjud biex jinibixxi l-attività tal-proteasome, u fil-fatt sibna li l-proċess ta' degradazzjoni tagħhom kien inibit (Fig. 5f).Miri addizzjonali mhux ta 'sottostrat ġew ikkonfermati bħala interatturi Parkin bl-użu ta' Western blotting (Figura Supplimentari 10), li wrew riżultati konsistenti ma 'LC-MS/MS.Bħala konklużjoni, l-integrazzjoni tal-fluss tax-xogħol PDPL mal-verifika tat-trasfezzjoni tal-proteina fil-mira tippermetti l-identifikazzjoni ta 'sottostrati E3 ligase mhux irreġistrati.
Aħna żviluppajna pjattaforma komuni għall-immarkar tal-prossimità li tippermettilek tidentifika POIs li jinteraġixxu fl-ispazju u fil-ħin.Il-pjattaforma hija bbażata fuq il-proteina fotosensibilizzatur miniSOG, li hija biss madwar 12 kDa, inqas minn nofs id-daqs tal-enzima APEX2 matura (27 kDa) u terz tad-daqs ta 'TurboID (35 kDa).Id-daqs iżgħar għandu jespandi ħafna l-firxa ta 'applikazzjonijiet għall-istudju ta' interatomi ta 'proteini żgħar.Aktar esplorazzjoni ta 'fotosensitizers addizzjonali, kemm jekk proteini kodifikati ġenetikament jew molekuli żgħar, hija meħtieġa biex tiżdied ir-rendiment quantum ta' ossiġnu singlet u tespandi s-sensittività ta 'dan l-approċċ.Għall-verżjoni attwali ta 'miniSOG, tista' tinkiseb riżoluzzjoni temporali għolja bl-użu ta 'illuminazzjoni blu biex jiġu attivati ​​l-markers ta' prossimità.Barra minn hekk, ħin ta 'espożizzjoni itwal rilaxxat "sħaba" akbar ta' ossiġnu singlet, li rriżulta f'modifika ta 'residwi aktar distali ta' histidine, żieda fir-raġġ tat-tikkettar, u l-abbiltà li tirfina r-riżoluzzjoni spazjali PDPL.Ittestjajna wkoll seba 'sondi kimiċi biex iżidu l-proporzjon tas-sinjal għall-isfond u esplorajna l-mekkaniżmu molekulari wara dan l-approċċ.Il-fluss tax-xogħol TOP-ABPP flimkien ma 'tfittxija miftuħa imparzjali kkonfermat li modifiki seħħew biss fl-istidini u l-ebda mikroambjent konsistenti ma ġie osservat għal modifiki miżjuda ta' histidine, ħlief għal preferenza moderata għal histidines fir-reġjun tal-linja.
PDPL intuża wkoll biex jikkaratterizza proteomes subċellulari b'ispeċifiċità u kopertura tal-proteome għall-inqas komparabbli ma' metodi oħra ta 'tikkettjar ta' prossimità u sonda kimika speċifika għall-organelle.Markers tal-prossimità ntużaw ukoll b'suċċess biex jikkaratterizzaw il-proteomes tal-wiċċ, liżosomali u assoċjati mas-sekretomi46,47.Aħna nemmnu li PDPL se jkun kompatibbli ma 'dawn l-organelli subċellulari.Barra minn hekk, sfidajna l-PDPL billi identifikajna miri għat-twaħħil tal-proteini ċitosoliċi li huma aktar kumplessi minn proteini marbuta mal-membrana minħabba l-proprjetajiet dinamiċi tagħhom u l-involviment f'aktar interazzjonijiet temporali.PDPL ġie applikat għal żewġ proteini, il-koattivatur tat-traskrizzjoni BRD4 u l-ligase E3 Parkin assoċjata mal-marda.Dawn iż-żewġ proteini ġew magħżula mhux biss għall-funzjonijiet bijoloġiċi fundamentali tagħhom, iżda wkoll għar-rilevanza klinika u l-potenzjal terapewtiku tagħhom.Għal dawn iż-żewġ POIs, ġew identifikati sħab vinkolanti magħrufa kif ukoll miri mhux irreġistrati.Notevolment, il-proteina assoċjata mas-separazzjoni tal-fażi SFPQ ġiet ikkonfermata minn ko-IP, li jista 'jindika mekkaniżmu ġdid li bih BRD4 (isoforma qasira) jirregola LLPS.Fl-istess ħin, nemmnu li l-identifikazzjoni tas-sottostrati ta 'Parkin hija xenarju li fih l-identifikazzjoni ta' adeżivi indiretti hija meħtieġa.Aħna identifikajna żewġ sottostrati tal-parkin mhux identifikati u kkonfermajna d-degradazzjoni tagħhom tul il-mogħdija ta 'ubiquitination-proteasome.Riċentement, ġiet żviluppata strateġija ta 'insib ibbażata fuq mekkaniżmu biex tiskopri sottostrati ta' hydrolase billi tinqabadhom b'enzimi.Għalkemm dan huwa metodu qawwi ħafna, mhuwiex adattat għall-analiżi ta 'sottostrati involuti fil-formazzjoni ta' kumplessi kbar u jeħtieġ il-formazzjoni ta 'rabtiet kovalenti bejn l-enzima u s-sottostrat.Nistennew li PDPL jista 'jiġi estiż biex jistudja kumplessi oħra ta' proteini u familji ta 'enzimi, bħall-familji deubiquitinase u metalloprotease.
Forma ġdida ta 'miniSOG, imsejħa SOPP3, ġiet żviluppata bi produzzjoni mtejba ta' ossiġnu singlet.Aħna qabblu miniSOG ma 'SOPP3 u sibna prestazzjoni mtejba tal-immarkar, għalkemm il-proporzjon tas-sinjal għall-istorbju baqa' ma nbidilx (Fig. 11 Supplimentari).Aħna ipoteżijna li l-ottimizzazzjoni ta 'SOPP3 (eż., permezz ta' evoluzzjoni diretta) twassal għal proteini fotosensittivi aktar effiċjenti li jeħtieġu ħinijiet ta 'dawl iqsar u b'hekk jippermettu li jinqabdu proċessi ċellulari aktar dinamiċi.Notevolment, il-verżjoni attwali tal-PDPL hija limitata għall-ambjent ċellulari peress li teħtieġ illuminazzjoni tad-dawl blu u ma tistax tippenetra t-tessuti fil-fond.Din il-karatteristika tipprekludi l-użu tagħha fi studji tal-mudelli tal-annimali.Madankollu, il-kombinazzjoni tal-optoġenetika ma 'PDPL tista' tipprovdi opportunità għar-riċerka fuq l-annimali, speċjalment fil-moħħ.Barra minn hekk, fotosensitizers infra-aħmar oħra inġinerija wkoll ineħħu din il-limitazzjoni.Bħalissa għaddejja riċerka f'dan il-qasam.
Il-linja taċ-ċelluli HEK293T inkisbet minn ATCC (CRL-3216).Il-linja taċ-ċelluli ttestjata negattiva għall-infezzjoni tal-mycoplasma u ġiet ikkultivata f'DMEM (Thermo, #C11995500BT) supplimentat b'10% serum bovin tal-fetu (FBS, Vistech, #SE100-B) u 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).imkabbra fi.
3-Aminophenylene (kampjun 3) u (4-ethynylphenyl)methanamine (kampjun 4) inxtraw minn Bidepharm.Propylamine (sonda 2) inxtara minn Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (sonda 1) ġie sintetizzat skont metodi ppubblikati.
Tabella Supplimentari 1 telenka l-kostruzzjonijiet ġenetiċi użati f'dan l-istudju.Is-sekwenzi miniSOG u KillerRed ġew ikklonati minn plasmid rigal minn P. Zou (Università ta 'Peking).Is-sekwenza tal-mira tal-matriċi mitokondrijali ġiet derivata mit-23 aċidu amminiku N-terminal ta 'COX4 u kklonata fil-vettori indikati bl-użu ta' assemblaġġ Gibson (Beyotime, #D7010S).Biex timmira l-membrana u n-nukleu tar-retikulu endoplasmiku, SEC61B DNA uman (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplifikat minn PCR minn librerija cDNA ta 'ċelloli HEK293T, u DNA H2B (donata minn D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) u kklonati, kif imsemmi hawn fuq.Sakemm ma jkunx indikat mod ieħor, ġeni oħra ta 'proteini użati għat-trasfezzjoni u l-kostruzzjoni ta' linji ta 'ċelluli stabbli ġew amplifikati bil-PCR mil-librerija tal-cDNA taċ-ċelluli HEK293T.G3S (GGGS) u G4S (GGGGS) intużaw bħala linkers bejn il-proteina tal-lixka u l-miniSOG.Tikketta tal-epitopi V5 (GKPIPNPLLGLDST) ġiet miżjuda ma 'dawn il-kostruzzjonijiet tal-fużjoni.Għall-espressjoni fil-mammiferi u biex tiġi stabbilita linja taċ-ċelluli stabbli, il-kostruzzjoni tal-fużjoni miniSOG ġiet subklonata fil-vettur lentivirali pLX304.Għall-espressjoni batterjali, miniSOG ġie kklonat fil-vettur pET21a ittikkettat 6xHis fit-terminal C.
Iċ-ċelluli HEK293T ġew miżrugħa f'2.0 x 105 ċelluli għal kull bir fi pjanċi b'sitt bir u trasfettati 24 siegħa wara bi plasmidi lentivirali rikombinanti (2.4 μg pLX304) u plasmidi tal-ippakkjar virali (1.5 μg psPAX2 u 1.2 μg bl-użu ta' pMD293T)00 b'(LiBepoyo80G) , #C0533), madwar 80% fużjoni.Wara t-trasfezzjoni matul il-lejl, il-medium inbidel u inkubat għal 24 siegħa oħra.Il-ġbir tal-virus sar wara 24, 48 u 72 siegħa.Qabel l-infezzjoni tal-linji taċ-ċelluli fil-mira, il-mezz virali ġie ffiltrat permezz ta 'filtru ta' 0.8 μm (Merck, #millex-GP) u polybrene (Solarbio, #H8761) ġie miżjud għal konċentrazzjoni ta '8 μg/ml.Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli tħallew jirkupraw billi jibdlu l-mezz.Iċ-ċelloli ġew magħżula bl-użu ta '5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) għall-ewwel tliet passaġġi bħala għażla stretti aktar baxxi.Imbagħad uża 20 μg/ml bħala reġimen aktar strett għat-tliet passaġġi li jmiss.
Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi kmamar ta '12-il bir (Ibidi, #81201) b'densità ta' madwar 20,000 ċellula għal kull bir.Biex ittejjeb l-adeżjoni taċ-ċelluli HEK293T, żid 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) dilwit f'salina buffered fosfat (PBS, Sangon, #B640435) f'37°C.Il-kmamar ġew ittrattati minn qabel għal siegħa u mbagħad tneħħew bil-PBS.Wara 24 siegħa, iċ-ċelluli ġew maħsula darba b'PBS, inkubati b'sonda 1 mM 3 f'soluzzjoni friska tal-melħ bilanċjat ta' Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) għal siegħa f'37 ° C, u mbagħad inkubati b'LED blu (460 nm). ).) ġew irradjati għal 10 min f'temperatura tal-kamra.Wara dan, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'PBS u ffissati b'4% formaldehyde f'PBS (Sangon, #E672002) għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra.Formaldehyde żejjed tneħħa miċ-ċelloli fissi billi ħasel tliet darbiet bil-PBS.Iċ-ċelloli mbagħad ġew permeabilizzati b'0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) f'PBS u maħsula 3 darbiet b'PBS.Imbagħad neħħi l-kamra u żid ma’ kull kampjun 25 µl ta’ taħlita ta’ reazzjoni tal-ikklikkja li fiha 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) u 0.5 mg/ml askorbat tas-sodju (Aladdin, Nru. S105024) u inkubat għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra.Wara reazzjoni snap, iċ-ċelloli ġew maħsula sitt darbiet b'PBS li kien fih 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) u mbagħad imblukkati b'5% BSA (Abcone, #B24726) f'PBST għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra.
Għall-immunostaining tal-kololizzazzjoni, iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorpi primarji skont il-kundizzjonijiet indikati: mAb tat-tikketta tal-ġurdien anti-V5 (1:500, CST, #80076), mAb anti-Hsp60 tal-fenek (1:1000), ABclonal, #A0564), antikorp poliklonali kontra l-kalnexin tal-fenek (1:500, Abcam, #ab22595) jew antikorp monoklonali anti-lamin A/C tal-fenek (1:500; CST, #2032) f'4 °C matul il-lejl.Wara l-ħasil 3 darbiet b'PBST, iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorpi sekondarji: mogħoż kontra l-fenek Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) dilwit 1:1000, mogħoż kontra l-ġurdien Alexa Fluor 594 (CST, #8889) dilwit 1:1000.dilwizzjoni Iddilwixxi f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta.Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula 3 darbiet b'PBST u kontrotebba b'DAPI (Thermo, #D1306) f'PBS għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra.Wara 3 ħasliet bil-PBS, iċ-ċelloli ġew issiġillati f'50% gliċerol (Sangon, #A600232) f'PBS għall-immaġini.Immaġini immunofluworexxenti nkisbu bl-użu ta 'mikroskopju konfokali ZEISS LSM 900 Airyscan2 u softwer ZNE 3.5.
Għal immaġini fluworexxenti tal-ossiġnu singlet, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn bil-buffer Hanks HEPES qabel ma żżid 100 nM Si-DMA fil-buffer Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Wara l-espożizzjoni għad-dawl, iċ-ċelloli ġew inkubati f'inkubatur tas-CO2 f'37 ° C għal 45 minuta.Iċ-ċelluli mbagħad inħaslu darbtejn bil-buffer HEPES ta' Hanks u ġew imtebba b'Hoechst fil-buffer HEPES ta' Hanks għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra u viżwalizzati bl-użu ta' mikroskopju konfokali ZEISS LSM 900., #M36008) f'buffer HBSS li fih il-kalċju u l-manjeżju.Wara l-espożizzjoni għad-dawl jew doxorubicin (MCE, #HY-15142A), iċ-ċelloli ġew inkubati f'inkubatur CO2 f'37 ° C għal 10 minuti, maħsula darbtejn b'buffer HBSS, u inkubati b'Hoechst f'buffer HBSS f'temperatura tal-kamra.minuti.Doxorubicin intuża bħala kontroll pożittiv tas-sonda fejn iċ-ċelloli ġew ittrattati b'20 μM doxorubicin f'HBSS li kien fih 1% BSA għal 30 min.Immaġini immunofluworexxenti nkisbu permezz ta 'mikroskopju konfokali Zeiss LSM 900.
Iċ-ċelloli HEK293T li jesprimu b'mod stabbli mito-miniSOG ġew miżrugħa f'densità ta 'madwar 30% f'platti ta' 15 ċm.Wara 48 siegħa, meta ntlaħqet ~ 80% konfluwenza, iċ-ċelloli ġew maħsula darba b'PBS, inkubati b'1 mM Probe 3 f'buffer HBSS frisk għal siegħa f'37 ° C u mbagħad imdawwal b'LED blu għal 10 minuti fil-kamra. temperatura..Minn hemm 'il quddiem, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'PBS, mibruxa u sospiżi mill-ġdid f'buffer PBS kiesaħ bis-silġ li fih inibituri tal-protease ħielsa mill-EDTA (MCE, #HY-K0011).Iċ-ċelluli ġew lysed billi tissenja l-ponta għal 1 minuta (1 sekonda mixgħula u 1 sekonda mitfija f'amplitudni ta '35%).It-taħlita li tirriżulta ġiet ċentrifugata f'15,871 xg għal 10 min f'4 ° C biex tneħħi d-debris, u l-konċentrazzjoni supernatant ġiet aġġustata għal 4 mg/mL bl-użu ta 'kit ta' analiżi tal-proteina BCA (Beyotime, #P0009).Għaqqad 1 ml tal-lisat ta 'hawn fuq ma' 0.1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), u 1 mM CuSO4 inkubatur bil-qiegħ rotazzjoni għal siegħa f'temperatura tal-kamra.Wara reazzjoni snap, żid it-taħlita mas-soluzzjoni mħallta minn qabel (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) f'kunjett tal-ħġieġ ta' 10 ml.Il-kampjuni tħalltu u ċentrifugati f'4500 g għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra.Is-soluzzjonijiet t'isfel u ta 'fuq ġew mormija, il-preċipitat ġie maħsul darbtejn b'1 ml ta' metanol u ċentrifugat f'15871 × g għal 5 min f'4 ° C.Żid 1 ml ta’ 8 M urea (Aladdin, nru U111902) f’bikarbonat ta’ l-ammonju 25 mM (ABC, Aladdin, nru A110539) biex tħoll il-preċipitat.Il-kampjuni ġew rikostitwiti b'10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 f'25 mM ABC) għal 40 minuta f'55 °C segwiti biż-żieda ta '15 mM iodoacetamide frisk (Sangon, #A600539) f'temperatura tal-kamra fid-dlam.Alkilazzjoni fi żmien 30 minuta..Ġie miżjud 5 mM dithiothreitol addizzjonali biex titwaqqaf ir-reazzjoni.Ipprepara madwar 100 µl NeutrAvidin agarose żibeġ (Thermo, #29202) għal kull kampjun billi taħsel 3 darbiet b'1 ml PBS.Is-soluzzjoni ta 'proteome ta' hawn fuq ġiet dilwita b'5 ml PBS u inkubata bi żibeġ ta' agarose NeutrAvidin maħsula minn qabel għal 4 sigħat f'temperatura tal-kamra.Iż-żibeġ imbagħad ġew maħsula 3 darbiet b'5 ml PBS li fihom 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 darbiet b'5 ml PBS li fih 1M urea, u 3 darbiet b'5 ml ddH2O.Iż-żibeġ imbagħad ġew maħsuda permezz ta 'ċentrifugazzjoni u sospiżi mill-ġdid f'200 μl ta' 25 mM ABC li fih 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) u 20 ng / μl trypsin (Promega, # V5280).Trypsinize matul il-lejl f'37 ° C b'rotazzjoni.Ir-reazzjoni twaqqaf billi żżid aċidu formiku (Thermo, # A117-50) sakemm il-pH laħaq 2-3.Iż-żibeġ ġew maħsula 3 darbiet b'1 ml ta 'PBS li kien fih 0.2% SDS, 3 darbiet b'1 ml ta' PBS li kien fih 1 M urea, u mbagħad 3 darbiet b'1 ml ta 'ilma distillat.Il-peptidi modifikati ġew rilaxxati b'liżi ħafifa (365 nm) għal 90 min bl-użu ta '200 μl ta' 70% MeOH.Wara ċ-ċentrifugazzjoni, inġabar is-supernatant.Iż-żibeġ imbagħad inħaslu darba b'100 μl ta' 70% MeOH u s-supernatanti ġew miġbura flimkien.Il-kampjuni ġew imnixxfa f'konċentratur tal-vakwu Speedvac u maħżuna f'-20 ° C sal-analiżi.
Biex jiġu identifikati u kwantifikati peptidi modifikati bl-ossiġnu singlet, il-kampjuni ġew maħlula mill-ġdid f'0.1% aċidu formiku u 1 μg ta 'peptidi ġew analizzati bl-użu ta' spettrometru tal-massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mgħammar b'sors nano ESI minn Tune u Xcalibur minn softwer tal-bejjiegħ 4.3.Il-kampjuni ġew separati fuq kolonna kapillari ippakkjata internament ta '75 µm × 15 cm b'materjal C18 ta' 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) u konnessi ma 'sistema EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Il-peptidi ġew separati permezz ta' kromatografija ta' gradjent lineari ta' 95 minuta minn 8% solvent B għal 50% solvent B (A = 0.1% aċidu formiku fl-ilma, B = 0.1% aċidu formiku f'80% aċetonitrile), imbagħad żdiedu b'mod lineari għal 98% B min f'6 min b'rata ta 'fluss ta' 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos jiġbor id-dejta alternattivament bejn l-iskannjar sħiħ tal-MS u l-iskannjar tal-MS2 skont id-dejta.Il-vultaġġ sputtering kien issettjat għal 2.1 kV u t-temperatura tal-kapillari tat-trasport tal-jone kienet 320 ° C.L-ispettri MS (350-2000 m/z) inġabru b'riżoluzzjoni ta '120,000, AGC 4 × 105, u ħin massimu ta' input ta '150 ms.L-10 prekursuri l-aktar komuni iċċarġjati bil-multiplikazzjoni f'kull skan sħiħ kienu frammentati bl-użu ta 'HCD b'enerġija ta' ħabta normalizzata ta '30%, tieqa ta' iżolament quadrupole ta '1.6 m/z, u setting ta' riżoluzzjoni ta '30,000.Mira AGC għal spettrometrija tal-massa tandem bl-użu ta' 5×104 u ħin massimu ta' input 150 ms.L-eċċezzjoni dinamika hija ssettjata għal 30 sekonda. Ioni mhux assenjati jew dawk bi ħlas ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS. Ioni mhux assenjati jew dawk bi ħlas ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ u >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni mhux assenjati jew joni bi ħlas ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ u >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni mhux speċifikati jew jonji bi ħlasijiet ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS.
Id-dejta mhux ipproċessata tiġi pproċessata bl-użu tal-pjattaforma tal-kompjuters FragPipe ibbażata fuq MSFragger.Il-preġudizzji tal-massa u l-aċidi amminiċi korrispondenti ġew determinati bl-użu ta 'algoritmu ta' tfittxija miftuħ b'tolleranza tal-massa tal-prekursur ta '-150 sa 500 Da.Peptidi modifikati mbagħad ġew identifikati bl-użu ta 'modifiki ta' histidine bi qligħ tal-massa ta '+229.0964 u +247.1069 Da f'PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Iċ-ċelloli li jesprimu b'mod stabbli l-ġene miniSOG imdewweb ġew miksija f'platti ta '6 ċm.Malli laħqet il-konfluwenza ta '~80%, iċ-ċelloli ġew maħsula darba b'HBSS (Gibco, #14025092), imbagħad inkubati b'sondi kimiċi f'HBSS għal siegħa f'37 ° C u illuminati b'dawl blu.10W LED għal 20 minuta f'temperatura tal-kamra.Biex tiddetermina liema tip ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv hija involuta fil-PDPL, 0.5 mM vitamina Ċ (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ġew miżjuda maċ-ċelloli bħala supplimenti.Wara l-ħasil b'PBS kiesaħ, iċ-ċelluli ġew mibruxa, miġbura f'tubi ċentrifugi ta '1.5 ml, u ivvibrati b'ponta għal 1 min f'200 μl ta' PBS b'inibitur ta 'protease 1x mingħajr EDTA (1 s u 1 s mingħajr, amplitudni 35%).It-taħlita li tirriżulta ġiet ċentrifugata f'15,871 × g għal 10 min f'4 °C u l-konċentrazzjoni tas-supernatant ġiet aġġustata għal 1 mg/mL bl-użu ta 'kit ta' analiżi tal-proteina BCA.Madwar 50 µl tal-lisat ta 'hawn fuq ġew inkubati b'0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, Nru. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, u 1 mM CuSO4 għal siegħa f'temperatura tal-kamra b'rotazzjoni minn isfel għal fuq.Wara r-reazzjoni tal-ikklikkja, twettqet preċipitazzjoni bl-aċetun billi żżid 250 μl ta 'aċetun imkessaħ minn qabel mal-kampjuni, inkuba f'-20 ° C għal 20 min u ċentrifuga f'6010 × g għal 10 min f'4 ° C.Iġbor il-gerbub u għalli f'50 µl ta' 1x buffer ta' Laemmli għal 10 min f'95 °C.Il-kampjuni mbagħad ġew analizzati fuq ġellijiet twal SDS-PAGE u viżwalizzati bl-użu tas-sistema tal-immaġini Bio-rad ChemiDoc MP Touch bis-softwer Image Lab Touch.
L-espressjoni u l-purifikazzjoni tal-proteina rikombinanti miniSOG-6xHis twettqu kif deskritt qabel.Fil-qosor, ċelluli E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) ġew trasformati b'pET21a-miniSOG-6xHis u l-espressjoni tal-proteina ġiet indotta b'0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Wara l-liżi taċ-ċelluli, il-proteini ġew ippurifikati bl-użu ta 'żibeġ ta' agarose Ni-NTA (MCE, nru. 70666), iddijalizzati kontra PBS, u maħżuna f'-80 ° C.
Għal analiżi tal-prossimità tat-tikketta in vitro bbażat fuq l-antikorpi, ħallat 100 μM miniSOG purifikat, 1 mM sonda 3, u 1 μg antikorp anti-tikketta tal-ġurdien monoklonali (TransGen, #HT501-01) f'PBS għal volum totali ta 'reazzjoni ta' 50 μl..It-taħlita ta 'reazzjoni ġiet irradjata b'dawl LED blu għal 0, 2, 5, 10, u 20 min f'temperatura tal-kamra.It-taħlita ġiet inkubata b'0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, u 1 mM CuSO4 għal siegħa f'temperatura tal-kamra fuq ċekċiek tal-moviment 'il fuq.Wara reazzjoni snap, żid 4x Laemmli's buffer direttament mat-taħlita u għalli f'95°C għal 10 min.Il-kampjuni ġew analizzati fuq ġellijiet SDS-PAGE u analizzati permezz ta 'western blotting bi streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Peptide sintetiku li fih l-istidina b'amidazzjoni C-terminal (LHDALDAK-CONH2) intuża biex janalizza tikkettjar in vitro ibbażat fuq peptidi fil-qrib.F'dan l-assaġġ, 100 μM miniSOG purifikat, 10 mM sonda 3 u 2 μg / ml peptide sintetiku tħalltu f'PBS f'volum ta 'reazzjoni totali ta' 50 μl.It-taħlita ta 'reazzjoni ġiet irradjata b'dawl LED blu għal siegħa f'temperatura tal-kamra.Mikrolitru wieħed ta 'kampjun ġie analizzat bl-użu ta' sistema LC-MS (Waters, spettrometru tal-massa SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight b'softwer ta 'analiżi tal-ispettru MassLynx).
Iċ-ċelloli HEK293T li jesprimu b'mod stabbli l-ġene tal-fużjoni miniSOG ġew miżrugħa f'dixxijiet ta '10 ċm għal linji b'lokalizzazzjoni ta' organelli differenti (Mito, ER, Nucleus) u platti ta '15 ċm għal linji Parkin-miniSOG u BRD4-miniSOG.Malli laħqu ~ 90% konfluwenza, iċ-ċelloli ġew maħsula darba b'HBSS, imbagħad inkubati bis-sonda 3 f'HBSS għal siegħa f'37 ° C u mdawwal b'LED blu ta '10 W f'temperatura tal-kamra.Għal tikkettar mingħajr kuntatt ta 'Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) bis-sonda 3 f'HBSS ġie miżjud għal siegħa f'37 °C.Il-liżi taċ-ċelluli, il-kimika tal-ikklikkja, it-tnaqqis u l-passi tal-alkilazzjoni kienu l-istess kif deskritt hawn fuq, ħlief li ġew miżjuda 2 mg ta 'lysate u intuża l-biotin PEG3 azide fir-reazzjoni tal-ikklikkja minflok il-biotin azide fotodegradabbli.Wara l-arrikkiment, iż-żibeġ ġew maħsula 3 darbiet b'5 ml ta' PBS li kien fihom 0.2% SDS, 3 darbiet b'5 ml ta' PBS li kien fih 1 M urea, u 3 darbiet b'5 ml ta' PBS.Minn hemm 'il quddiem, 2 µg trypsin ġiet miżjuda ma' 300 µl 25 mM ABC li kien fih 1 M urea biex tinqasam il-proteina matul il-lejl f'37°C.Ir-reazzjoni twaqqfet billi żżid l-aċidu formiku sakemm intlaħaq pH ta' 2-3.Wara t-tripsinizzazzjoni fuq żibeġ, is-soluzzjoni tal-peptide ġiet imneħħija mill-melħ bl-użu ta' kolonna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) u mnixxfa f'konċentratur tal-vakwu Speedvac.Il-peptidi ġew maħlul mill-ġdid f'0.1% aċidu formiku u 500 ng ta 'peptidi ġew analizzati bl-użu ta' spettrometru tal-massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mgħammar bis-sors nano-ESI deskritt hawn fuq.Peptidi ġew separati fuq prekolonni kummerċjali RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, nru. 164946) u kolonni analitiċi RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, nru. 164941), it-tnejn mimlija b'2 μm.gradjent minn 8% sa 35% ACN f'60 minuta, imbagħad żdied b'mod lineari għal 98% B f'6 minuti b'rata ta 'fluss ta' 300 Nl/min.L-ispettri MS (350-1500 m/z) inġabru b'riżoluzzjoni ta '60,000, AGC 4 × 105, u ħin ta' input massimu ta '50 ms.Il-joni magħżula kienu frammentati b'mod sekwenzjali minn HCD f'ċikli ta '3 s b'enerġija ta' ħabta normalizzata ta '30%, tieqa ta' iżolament quadrupole ta '1.6 m / z, u riżoluzzjoni ta' 15000. Mira AGC tal-ispettrometru tal-massa tandem 5 × 104 u ħin massimu ta 'injezzjoni ta’ 22 ms ġew użati.L-esklużjoni dinamika hija ssettjata għal 45 sekonda. Ioni mhux assenjati jew dawk bi ħlas ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS. Ioni mhux assenjati jew dawk bi ħlas ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ u >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni mhux assenjati jew joni bi ħlas ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ u >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni mhux speċifikati jew jonji bi ħlasijiet ta '1+ u> 7+ ġew rifjutati għal MS/MS.
Il-passi tal-preparazzjoni tal-kampjun sa l-arrikkiment taż-żibeġ NeutrAvidin kienu l-istess bħal fl-analiżi LC-MS/MS deskritta hawn fuq.Madwar 50 μg ta 'lysate intużaw bħala input għall-kontroll tat-tagħbija u 2 mg ta' lysate intużaw għal reazzjonijiet tal-ikklikkjar.Wara l-arrikkiment u l-ħasil bin-newtravidin, il-proteini marbuta ġew elużi billi żżid 50 μl ta 'buffer ta' Laemmli mal-żibeġ tar-reżina tal-agarose u jagħli f'95 ° C għal 5 minuti.L-input tat-tagħbija tal-kontroll u l-kampjuni arrikkit żibeġ ġew analizzati minn SDS-PAGE u trasferiti għal membrani PVDF (Millipore, #ISEQ00010) b'metodi standard Western blot.Il-membrani ġew imblukkati b'5% ħalib xkumat (Sangon, #A600669) f'TBS li kien fih 0.1% tween-20 (TBST) u inkubati sekwenzjali b'antikorpi primarji u sekondarji.Antikorpi primarji ġew dilwiti 1:1000 f'5% ħalib xkumat f'TBST u inkubati matul il-lejl f'4°C.Antikorpi sekondarji ġew użati fi proporzjon ta '1:5000 u inkubati għal siegħa f'temperatura tal-kamra.Il-membrani ġew viżwalizzati permezz ta' kimiluminixxenza bl-użu tas-sistema tal-immaġini Chemidoc MP.L-iskans mhux maqtugħin kollha ta 'blots u ġellijiet fil-figura huma ppreżentati bħala data mhux maħduma.
L-antikorpi primarji użati f'dan l-istudju kienu jinkludu antikorp monoklonali tal-fenek anti-SFPQ (CST, nru. 71992), antikorp monoklonali tal-fenek anti-FUS (CST, nru. 67840), antikorp poliklonali tal-fenek anti-NSUN2 (Proteintech, nru. 20854-1- AP), antikorp poliklonali anti-mSin3A tal-fenek (Abcam, #ab3479), antikorp monoklonali tal-ġurdien kontra t-tikketta (TransGen, #HT201-02), antikorp monoklonali tal-ġrieden anti-β-actin (TransGen, #HC201-01), anti-fenek -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), fenek monoclonal antibody to CTBP1 (ABclonal, #A11600), fenek polyclonal antibody to DUT (ABclonal, #A2901), fenek polyclonal antibody to PSMC4 (ABclonal, #A2505), fenek anti- Antikorp poliklonali DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Dawn l-antikorpi ntużaw f'dilwizzjoni ta' 1:1000 f'5% ħalib xkumat f'TBST.L-antikorpi sekondarji użati f'dan l-istudju kienu jinkludu IgG kontra l-fenek (TransGen, #HS101-01), IgG kontra l-ġurdien (TransGen, #HS201-01) f'dilwizzjoni 1:5000.
Biex tinvestiga aktar jekk BRD4 jinteraġixxix ma 'SFPQ, ċelluli stabbli HEK293T u BRD4-miniSOG li jesprimu żżejjed HEK293T ġew indurati f'platti ta' 10 ċm.Iċ-ċelloli ġew maħsula b'PBS kiesaħ u lysed f'1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) b'inibitur tal-protease mingħajr EDTA għal 30 minuta f'4 ° C.Wara dan, il-lysates inġabru f'tubi ċentrifugi ta '1.5 ml u ċentrifugati f'15,871 xg għal 10 min f'4 ° C.Is-supernatant ġie maħsud u inkubat b'5 µg ta' antikorp monoklonali tal-ġurdien tikkettat anti-V5 (CST, #80076) matul il-lejl f'4°C.Aħsel madwar 50 µl ta' żibeġ manjetiċi tal-proteina A/G (MCE, #HY-K0202) darbtejn b'PBS li jkun fih 0.5% Tween-20.Imbagħad il-lysates taċ-ċelluli ġew inkubati bi żibeġ manjetiċi għal 4 sigħat f'4 ° C b'rotazzjoni minn isfel għal fuq.Imbagħad iż-żibeġ ġew maħsula erba 'darbiet b'1 ml ta' buffer PBST u mgħollija f'95 ° C għal 5 min.Il-kampjuni ġew analizzati fuq ġellijiet SDS-PAGE u trasferiti għal membrani PVDF bl-użu ta 'metodi standard Western blot.Il-membrani ġew imblukkati f'5% ħalib xkumat f'TBST u inkubati sekwenzjali b'antikorpi primarji u sekondarji.Antikorp Primarju Fenek anti-SFPQ monoklonali (CST, #71992) intuża fi proporzjon ta '1:1000 f'5% ħalib xkumat f'TBST u inkubat matul il-lejl f'4 °C.IgG kontra l-fenek intuża fi proporzjon ta '1:5000 u inkubat għal siegħa f'temperatura tal-kamra.Il-membrani ġew viżwalizzati permezz ta' kimiluminixxenza bl-użu tas-sistema tal-immaġini Chemidoc MP.
L-istrutturi kollha użati għall-analiżi taż-Żona tal-wiċċ Aċċessibbli għas-Solvent (SASA) inkisbu mill-Protein Data Bank (PDB)52 jew mill-AlphaFold Protein Structure Database53.SASA assoluta ġiet ikkalkulata għal kull residwu bl-użu tal-programm FreeSASA.Intużat biss dejta SASA kompluta u mhux ambigwa għal histidine ittikkettat u l-ġirien tagħha biex tinkiseb is-SASA medja għal kull struttura.L-aċċessibbiltà relattiva tas-solvent (RSA) għal kull histidine ġiet ikkalkulata billi l-valur assolut SASA jiġi diviż bl-erja empirika massima possibbli tar-residwi disponibbli għas-solvent.L-istidini kollha mbagħad ġew ikklassifikati bħala moħbija jekk l-RSA medja kienet taħt l-20%, inkella esposti56.
Fajls mhux ipproċessati miksuba fil-mod DDA ġew imfittxija bl-użu ta 'Proteome Discoverer (v2.5) jew MSfragger (Fragpipe v15.0) fid-database tal-proteini verifikata SwissProt xierqa li fiha kontaminanti komuni.Il-peptidi kienu jeħtieġu trypsin komplut b'żewġ siti ta' qsim neqsin, carbamoyl methylation bħala modifika fissa u ossidazzjoni tal-methionine bħala modifika dinamika.It-tolleranzi tal-piż tal-prekursur u tal-framment ġew issettjati għal 10 ppm u 0.02 Da (MS2 Orbitrap), rispettivament. Tneħħew hits kontaminanti, u l-proteini ġew iffiltrati biex tinkiseb rata ta 'skoperta falza ta' <1%. Tneħħew hits kontaminanti, u l-proteini ġew iffiltrati biex tinkiseb rata ta 'skoperta falza ta' <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полуфи полуфи 1%. Il-hits ta' kontaminanti tneħħew u l-proteini ffiltrati biex jagħtu rata ta' skoperta falza ta' <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены. Il-hits ta' kontaminanti tneħħew u l-proteini ffiltrati biex tinkiseb rata pożittiva falza ta' <1%.Għal analiżi kwantitattiva mingħajr l-użu ta 'tikketti, intuża kontenut ta' proteina normalizzat minn tliet ripetizzjonijiet bijoloġiċi.L-analiżi tal-lokalizzazzjoni subċellulari tal-proteini saret bl-użu ta 'analiżi tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) minn DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 u databases miġbura u ppubblikata mill-grupp Alice Ting.Il-mappa tal-vulkan inkisbet minn Perseus (v1.6.15.0). Bidliet fl-abbundanza tal-proteini ġew ittestjati għal sinifikat statistiku bl-użu ta 'test t fuq żewġ naħat, u hits tal-proteini ġew identifikati b'bidla fl-abbundanza> 2 (sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor) u valur p <0.05. Bidliet fl-abbundanza tal-proteini ġew ittestjati għal sinifikat statistiku bl-użu ta 'test t fuq żewġ naħat, u hits tal-proteini ġew identifikati b'bidla fl-abbundanza> 2 (sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor) u valur p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Bidliet tal-ħinijiet tal-kontenut tal-proteini ġew ittestjati għas-sinifikat statistiku bl-użu ta 'test t b'żewġ denbu, u t-taqbil tal-proteini ġew identifikati b'bidla fil-kontenut> 2 (sakemm ma jkunx innutat mod ieħor) u valur ap <0.05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Is-sinifikat statistiku tal-bidliet darbiet fil-kontenut tal-proteini ġie ttestjat bl-użu ta 'test t b'żewġ denbu, u t-taqbil tal-proteini ġew determinati għal bidliet fil-kontenut > 2 (sakemm ma jkunx indikat mod ieħor) u valuri p <0.05.L-analiżi tal-interazzjoni tal-proteini saret bl-użu tal-analiżi GO flimkien mad-database String.
Twettqu tliet repliki bijoloġiċi b'riżultati simili.Analiżi statistika saret bil-GraphPad Prism (softwer GraphPad) u plots tal-vulkan ġew iġġenerati b'Perseus (v1.6.15.0).Biex tqabbel iż-żewġ gruppi, il-valuri p ġew determinati bl-użu ta 'test t ta' Student b'żewġ denbu.Proteini singleton identifikati mill-inqas darbtejn fil-grupp sperimentali biss ġew inklużi fil-plots tal-vulkan, u l-valuri korrispondenti neqsin fil-grupp ta 'kontroll ġew sostitwiti b'Perseus minn distribuzzjoni normali sabiex il-valur p jista' jiġi kkalkulat.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard.F'analiżi proteomika għall-analiżi statistika, inżammet l-abbundanza ta 'proteini li dehru f'mill-inqas żewġ repliki bijoloġiċi.Metodi statistiċi ma ntużawx biex jiġi ddeterminat minn qabel id-daqs tal-kampjun.L-esperimenti mhumiex każwali.Ir-riċerkaturi ma kinux għomja għall-kompiti matul l-esperiment u l-evalwazzjoni tar-riżultati.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-astratt tar-Rapport tar-Riċerka dwar in-Natura marbut ma’ dan l-artikolu.
Id-dejta tal-ispettrometrija tal-massa miksuba f'dan l-istudju ġiet sottomessa lill-Konsorzju ProteomeXchange permezz tar-repożitorju tal-imsieħba tal-iProX57 taħt id-dataset ID PXD034811 (dataset PDPL-MS).Data mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta 'fajls ta' data mhux ipproċessata.Dan l-artikolu jipprovdi d-dejta oriġinali.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Insiru nafu l-viċinat: bl-użu ta 'bijotinilazzjoni dipendenti mill-prossimità biex tikkaratterizza kumplessi ta' proteini u organelli tal-mappa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Insiru nafu l-viċinat: bl-użu ta 'bijotinilazzjoni dipendenti mill-prossimità biex tikkaratterizza kumplessi ta' proteini u organelli tal-mappa.Gingras, AS, Abe, KT u Raut, B. Familjarità ma 'l-inħawi: bl-użu ta' bijotinilazzjoni dipendenti mill-prossimità biex tikkaratterizza kumplessi ta 'proteini u organelli tal-mappa. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘合物并绘绘 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Nifhmu l-viċinat: uża d-dipendenza tal-viċinat fuq il-ħajja bijoloġika.Gingras, AS, Abe, KT u Raut, B. Fehim ta 'prossimità: karatterizzazzjoni ta' kumplessi ta 'proteini u mapping ta' organelli bl-użu ta 'bijotinilazzjoni dipendenti mill-prossimità.Kurrenti.L-opinjoni tiegħi.Kimika.bijoloġija 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Immappjar tal-mikroambjent billi tittrasferixxi l-enerġija Dexter għal ċelloli immuni.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Netwerks fuq skala ta 'żewġ proteomi jiskopru remodeling speċifiku taċ-ċelluli ta' l-interatomi tal-bniedem.Ċelloli 184, 3022–3040.e3028 (2021).

Ħin tal-post: 15-Settembru 2022