Strateġiji dijanjostiċi tradizzjonali għall-iskoperta ta 'mard infettiv jeħtieġu l-użu ta' strumenti tal-bank li mhumiex adattati għall-ittestjar fil-punt tal-kura (POCT).Il-mikrofluwidi emerġenti hija teknoloġija minjaturizzata, awtomatizzata u integrata ħafna li hija alternattiva potenzjali għall-metodi tradizzjonali għal dijanjostika fuq il-post veloċi, bi prezz baxx u preċiża.Il-metodi dijanjostiċi molekulari jintużaw ħafna f'apparat mikrofluwidi bħala l-aktar metodi effettivi għall-iskoperta tal-patoġenu.Din ir-reviżjoni tiġbor fil-qosor l-avvanzi reċenti fid-dijanjostika molekulari bbażata fuq mikrofluwidi ta 'mard infettiv kemm minn perspettiva akkademika kif ukoll industrijali.L-ewwel, niddeskrivu proċessar tipiku fuq iċ-ċippa ta 'aċidi nuklejċi, inkluż trattament minn qabel tal-kampjun, amplifikazzjoni u qari tas-sinjali.Imbagħad jitqabblu l-karatteristiċi, il-vantaġġi u l-iżvantaġġi tal-erba 'tipi ta' pjattaformi mikrofluwidiċi.Sussegwentement, ser niddiskutu l-użu ta 'assaġġi diġitali għall-kwantifikazzjoni assoluta ta' aċidi nuklejċi.Kemm l-apparati dijanjostiċi molekulari klassiċi kif ukoll reċenti kummerċjali bbażati fuq mikrofluwidi huma miġbura fil-qosor bħala evidenza tal-istat attwali tas-suq.Fl-aħħarnett, nipproponu direzzjonijiet futuri għal dijanjosi mikrofluwidika ta 'mard infettiv.
Mard infettiv huwa kkawżat minn patoġeni, inklużi batterji, viruses, u parassiti, li huma mqassma madwar id-dinja.B'differenza minn mard ieħor, il-patoġeni malajr jiġu infettati u jinfirxu bejn il-bnedmin u l-annimali ospitanti permezz ta' tilqim, arja u midja tal-ilma [1].Il-prevenzjoni ta' mard infettiv hija kritika bħala miżura tas-saħħa pubblika.Tliet strateġiji ewlenin għall-ġlieda kontra l-mard infettiv: (1) jikkontrollaw is-sors tal-infezzjoni;(2) interruzzjoni tal-mogħdija tat-trasmissjoni;(3) protezzjoni ta' popolazzjonijiet suxxettibbli.Fost l-istrateġiji ewlenin, il-kontroll tas-sors ta 'infezzjoni huwa meqjus bħala l-aktar strateġija importanti minħabba l-konvenjenza u l-ispiża baxxa tiegħu.Dijanjosi rapida, iżolament, u trattament ta 'individwi infettati huma kritiċi, li jeħtieġu strateġiji dijanjostiċi veloċi, sensittivi u preċiżi [2].Id-dijanjosi attwali ta 'mard infettiv normalment tgħaqqad eżami kliniku bbażat fuq sinjali u sintomi u studji tal-laboratorju bħal kultura taċ-ċelluli u dijanjostiċi molekulari, li jeħtieġu persunal imħarreġ, proċeduri li jirrikjedu ħafna xogħol, u tagħmir għall-ittestjar għali [3, 4].Il-prevenzjoni ta' tifqigħat ta' mard infettiv teħtieġ dijanjosi lokali rapida, irħas u preċiża, speċjalment f'żoni b'riżorsi limitati fejn il-mard infettiv huwa komuni u sever [5], kif ukoll trattament fid-deżert jew fil-kamp tal-battalja, fejn l-emerġenzi huma imprevedibbli..il-kura medika hija limitata [6].F'dan il-kuntest, il-mikrofluwidi hija teknoloġija li tgħaqqad it-teknoloġiji tas-sistemi mikroelettromekkaniċi, in-nanoteknoloġija, jew ix-xjenza tal-materjali għal manipulazzjoni preċiża tal-fluwidu [7,8,9,10], li tipprovdi possibbiltajiet ġodda għall-iskoperta tal-punt tal-kura (POCT).) aġenti infettivi barra sptarijiet u laboratorji.Meta mqabbla mad-dijanjostika tradizzjonali li tieħu ħafna ħin, it-teknoloġija mikrofluwidika toffri ffrankar ta 'kampjuni u spejjeż għad-dijanjostika molekulari waqt it-tifqigħat tal-mard.It-tixrid globali tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19) huwa kkawżat minn koronavirus 2 tas-sindromu respiratorju akut sever (SARS-CoV-2), għalhekk l-importanza tal-mikrofluwidi għall-prevenzjoni u l-kontroll f'waqthom tal-pandemija hija għal darb'oħra enfasizzata [11, 12]. , 13].B'differenza mid-dijanjostika tradizzjonali, il-POCT mikrofluwidiku juża apparati portabbli żgħar li jvarjaw minn analizzaturi fuq il-bank għal strixxi żgħar tat-test sidestream biex jittestja ħdejn il-punt tal-kampjunar [14].Dawn it-testijiet għandhom preparazzjoni simplistika jew l-ebda kampjun, amplifikazzjoni veloċi tas-sinjal, u qari sensittiv tas-sinjali li jirriżultaw f'tul qasir u riżultati preċiżi fi ftit minuti.Id-disponibbiltà u l-produzzjoni tal-massa ta 'strumenti tal-kura tas-saħħa bbażati fuq mikrofluwidi espandew l-applikazzjonijiet dijanjostiċi tagħhom kost-effettivi u diretti barra l-isptar, ħdejn il-pazjent, u anke fid-dar.
Fost l-istrateġiji eżistenti għad-dijanjosi ta 'mard infettiv, id-dijanjostika molekulari hija waħda mill-aktar sensittivi [15, 16].Barra minn hekk, id-dijanjostika molekulari ħafna drabi tintuża bħala l-istandard tad-deheb għal skoperta kontinwa ta 'COVID-19, li tippermetti skoperta diretta ta' reġjuni speċifiċi għall-virus ta 'RNA jew DNA qabel il-bidu ta' rispons immuni [17, 18].Fir-reviżjoni attwali, aħna nippreżentaw l-aħħar avvanzi fi proċessi dijanjostiċi molekulari bbażati fuq mikrofluwidi għal mard infettiv, minn perspettiva akkademika għal perspettivi industrijali futuri (Fig. 1).Se nibdew bi tliet passi ewlenin fis-sejbien tal-aċidu nuklejku: trattament minn qabel tal-kampjun fuq iċ-ċippa, amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku, u qari tas-sinjali.Imbagħad qabbilna tipi differenti ta 'pjattaformi mikrofluwidi bl-istruttura u l-funzjoni tagħhom, u wrew karatteristiċi uniċi (qawwiet u dgħufijiet).Is-sejbien tal-aċidu nuklejku diġitali huwa diskuss aktar u jingħata bħala eżempju ta 'teknoloġija tat-tielet ġenerazzjoni għall-kwantifikazzjoni assoluta ta' molekuli ta 'patoġenu infettiv.Barra minn hekk, se jiġu ppreżentati diversi apparati POCT kummerċjali tipiċi u riċenti biex juru l-istat attwali tas-suq tal-POCT mikrofluwidi għad-dijanjostika molekulari.Se niddiskutu u nispjegaw ukoll il-viżjoni tagħna għal applikazzjonijiet futuri.
Moduli ta 'ċipep mikrofluwidi għall-iskoperta ta' aċidu nuklejku jistgħu jinqasmu fi tliet kategoriji (teħid ta 'kampjuni, rikonoxximent u sinjalazzjoni) skond il-funzjonijiet tagħhom [19].Fost dawn il-moduli, il-modulu tat-teħid tal-kampjuni prinċipalment jirrealizza l-liżi tal-kampjun u l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku.Il-modulu tas-sensorju jikkontrolla prinċipalment il-konverżjoni u l-amplifikazzjoni tas-sinjali tal-aċidu nuklejku.Il-modulu tas-sinjalar jiskopri s-sinjal konvertit u pproċessat mill-modulu sensing.Ibbażat fuq il-proċess ta 'skoperta ta' aċidi nuklejċi fuq ċippa, aħna se niġbru fil-qosor id-diversi ċipep li jistgħu jirrealizzaw il-funzjoni ta '"input u output".
L-ewwel pass fl-iskoperta ta' l-aċidu nuklejku huwa l-estrazzjoni ta' l-aċidu nuklejku, jiġifieri l-iżolament ta' l-aċidu nuklejku fil-mira mill-kampjun oriġinali.L-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku titwettaq biex tippurifika l-aċidi nuklejċi minn kontaminanti molekulari oħra, tiżgura l-integrità tal-istruttura primarja tal-molekuli tal-aċidu nuklejku, u tottimizza r-riżultati.L-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku teħtieġ il-liżi tal-kampjun meħtieġa u l-qbid tal-aċidu nuklejku, li l-kwalità u l-effiċjenza tagħhom għandhom impatt kbir fuq ir-riċerka u r-riżultati dijanjostiċi.Kwalunkwe effetti sekondarji sottili waqt l-estrazzjoni jistgħu jillimitaw aktar skoperta.Pereżempju, metodi ta 'reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) u amplifikazzjoni isotermali tal-linja (LAMP) huma inibiti minn xi solventi organiċi residwi bħal etanol u isopropanol f'reaġenti ta' iżolament tal-aċidu nuklejku [20].L-estrazzjoni likwidu-likwidu u l-estrazzjoni fil-fażi solida huma l-aktar metodi popolari għall-iżolament tal-aċidi nuklejċi [21], madankollu, l-estrazzjoni likwidu-likwidu fuq ċippa hija estremament limitata, peress li r-reaġenti użati fl-estrazzjoni likwidu-likwidu jikkawżaw korrużjoni tal-biċċa l-kbira taċ-ċipep mikrofluwidi. .Hawnhekk, aħna nenfasizzaw metodi ta 'estrazzjoni ta' fażi solida bbażati fuq mikroarray u nqabblu l-vantaġġi u l-iżvantaġġi tagħhom.
Is-silikon huwa materjal sottostrat kompatibbli mal-aċidi nuklejċi minħabba l-bijokompatibilità, l-istabbiltà u l-faċilità tal-modifika tiegħu [22].Importanti, meta jiġi modifikat bis-silika jew materjali oħra, dan il-kompost juri proprjetajiet biex jassorbi aċidi nuklejċi ċċarġjati b'mod negattiv taħt pH baxx, kundizzjonijiet ta 'melħ għoli filwaqt li elużjoni b'soluzzjonijiet ta' pH għoli u baxx ta 'melħ.Ibbażat fuq dan il-fenomenu, huwa possibbli li l-aċidu nuklejku jiġi purifikat.
Diversi forom ta 'materjali bbażati fuq is-silika ġew użati għall-estrazzjoni ta' aċidu nuklejku fil-mikrofluwidi, bħal żibeġ tas-silika, trabijiet, filtri tal-mikrofibra u membrani tas-silika [23, 24, 25, 26].Skont il-proprjetajiet tal-materjal, materjali bbażati fuq is-silikon jistgħu jintużaw f'mikroċirkwiti b'modi differenti.Pereżempju, granuli tas-silika, trabijiet u nanofiltri kummerċjali jistgħu sempliċement jitqiegħdu fil-pori jew mikrokanali ta 'ċipep mikrofluwidi u jgħinu biex jiġu estratti l-aċidi nuklejċi minn kampjuni [27, 28, 29].Membrani tas-silika modifikati bil-wiċċ jistgħu jintużaw ukoll biex jippurifikaw malajr id-DNA minn patoġeni bi prezz baxx.Per eżempju, Wang et al.[30] Billi tgħaqqad reazzjonijiet ta 'amplifikazzjoni ta' denaturazzjoni bi skambju ta 'katina medjat mill-vesikule ma' membrani tas-silika miksija b'oligosakkaridi ta 'chitosan, ġiet introdotta sistema portabbli versatili li sabet b'suċċess 102-108 unitajiet li jiffurmaw kolonja.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., u l-preżenza tal-virus kienet faċilment viżibbli.Powell et al.[31] Mikroarrays ibbażati fuq is-silikon imbagħad intużaw biex jinstabu l-virus tal-epatite C (HCV), il-virus tal-immunodefiċjenza umana (HIV), il-virus Zika, u l-papillomavirus uman u propagazzjoni awtomatika, li fiha ġie żviluppat mikroreattur tortuous ta '1.3 μl biex jaqbad viruses RNA.u twettaq amplifikazzjoni in situ.Minbarra dawn il-metodi, mikrokolonni tas-silika modifikati fil-wiċċ għandhom ukoll rwol ewlieni fl-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, peress li l-ġeometrija u l-proprjetajiet tal-materjal li jimmodifika jżidu ħafna l-effiċjenza tal-estrazzjoni.Chen et al.[32] ippropona pjattaforma mikrofluwidika għall-iżolament ta 'RNA ta' konċentrazzjoni baxxa bbażata fuq mikrokolonni tas-silikon miksi bl-amino.Dan l-apparat mikrofluwidu jintegra firxa ta 'mikropilastri ta' 0.25 cm2 fuq sottostrat tas-silikon biex tinkiseb effiċjenza ogħla ta 'estrazzjoni permezz ta' disinn ta 'proporzjon għoli ta' żona tal-wiċċ għal volum.Il-vantaġġ ta 'dan id-disinn huwa li l-apparat mikrofluwidu jista' jikseb sa 95% ta 'effiċjenza ta' estrazzjoni ta 'aċidu nuklejku.Dawn l-istrateġiji bbażati fuq is-silikon juru l-valur tal-iżolament rapidu tal-aċidi nuklejċi bi prezz baxx.Flimkien ma 'ċipep mikrofluwidi, strateġiji ta' estrazzjoni bbażati fuq is-silikon jistgħu mhux biss iżidu l-effiċjenza tas-sejbien ta 'aċidu nuklejku, iżda wkoll jiffaċilitaw il-minjaturizzazzjoni u l-integrazzjoni ta' apparat analitiku [20].
Metodi ta 'separazzjoni manjetika jużaw partiċelli manjetiċi biex jiżolaw l-aċidi nuklejċi fil-preżenza ta' kamp manjetiku estern.Partiċelli manjetiċi komunement użati jinkludu partiċelli manjetiċi Fe3O4 jew γ-Fe2O3 miksija bis-silika, amino u carboxyl [33,34,35,36].Il-karatteristika distintiva tal-partiċelli manjetiċi meta mqabbla ma 'metodi SPE bbażati fuq is-silikon hija l-faċilità ta' manipulazzjoni u kontroll b'kalamiti esterni.
Bl-użu tal-interazzjoni elettrostatika bejn l-aċidi nuklejċi u s-silika, taħt kundizzjonijiet ta 'melħ għoli u pH baxx, l-aċidi nuklejċi huma adsorbiti fuq il-wiċċ ta' partiċelli manjetiċi miksija bis-silika, filwaqt li taħt kundizzjonijiet ta 'melħ baxx u pH għoli, il-molekuli jistgħu jinħaslu. mill-ġdid..Żibeġ manjetiċi miksija bis-silika jagħmluha possibbli li jiġi estratt DNA minn kampjuni ta 'volum kbir (400 μL) bl-użu ta' moviment ikkontrollat manjetikament [37].Bħala dimostrazzjoni, Rodriguez-Mateos et al.[38] uża kalamiti tunable biex jikkontrollaw it-trasferiment ta 'żibeġ manjetiċi għal kmamar differenti.Ibbażat fuq partiċelli manjetiċi miksija bis-silika, 470 kopja/mL ta 'RNA ġenomika SARS-CoV-2 jistgħu jiġu estratti minn kampjuni ta' ilma mormi għal sejbien ta 'traskrizzjoni inversa ta' LAMP (RT-LAMP) u r-rispons jista 'jinqara fi żmien siegħa.għajn mikxufa (Fig. 2a).
Apparati bbażati fuq materjali manjetiċi u porużi.Dijagramma kunċettwali tal-apparat mikrofluwidiku IFAST RT-LAMP għall-iskoperta tal-RNA SARS-CoV-2 (adattat minn [38]).b Mikro-apparat ċentrifugali għal dSPE ta' aċidu nuklejku ta' swab buccal (adattat minn [39]).c Konċentratur tal-kampjuni li jaħdem waħdu inkorporat bl-użu ta' kard FTA® (adattat minn [50]).d Karta tal-filtru Fusion 5 modifikata b'chitosan (adattata minn [51]).SARS-CoV-2 sindromu respiratorju akut sever koronavirus 2, amplifikazzjoni iżotermika medjata minn loop ta' traskrizzjoni inversa RT-LAMP, imsieħba fit-teknoloġija tal-FTA finders, aċidu nuklejku NA
Partiċelli manjetiċi ċċarġjati b'mod pożittiv huma ideali biex iwaħħlu s-sinsla tal-fosfat ta 'aċidu nuklejku.F'ċerta konċentrazzjoni tal-melħ, il-gruppi tal-fosfat iċċarġjati b'mod negattiv ta 'aċidi nuklejċi jistgħu jiġu ċċarġjati b'mod pożittiv fuq il-wiċċ tal-partiċelli komposti manjetiċi.Għalhekk, nanopartiċelli manjetiċi b'wiċċ mhux maħdum u densità għolja ta 'gruppi amminiċi ġew żviluppati għall-estrazzjoni ta' aċidi nuklejċi.Wara s-separazzjoni manjetika u l-imblukkar, nanopartiċelli manjetiċi u kumplessi tad-DNA jistgħu jintużaw direttament fil-PCR, li jelimina l-ħtieġa għal operazzjonijiet ta 'purifikazzjoni u elużjoni kumplessi u li jieħdu ħafna ħin [35].Nanopartiċelli manjetiċi miksija bi gruppi karbossili negattivi ntużaw ukoll biex jisseparaw l-aċidi nuklejċi adsorbiti fuq uċuħ f'soluzzjonijiet ta 'polyethylene glycol u klorur tas-sodju ta' konċentrazzjoni għolja [36].B'dawn iż-żibeġ manjetiċi modifikati fil-wiċċ, l-estrazzjoni tad-DNA hija kompatibbli ma 'amplifikazzjoni sussegwenti.Dignan et al.[39] iddeskriva pjattaforma mikrofluwidi ċentrifugali awtomatizzata u portabbli għal trattament minn qabel ta 'aċidu nuklejku, li tippermetti lill-persunal mhux tekniku jużaha fuq il-post.Barra minn hekk, il-kompatibilità tad-DNA iżolat ma 'LAMP, metodu adattat tajjeb għall-analiżi tal-aċidu nuklejku fil-punt tal-kura, turi aktar rekwiżiti minimi ta' tagħmir u adattabilità għal analiżi kolorimetriċi (Fig. 2b).
Metodi ta 'żibeġ manjetiċi joffru l-possibbiltà ta' estrazzjoni awtomatizzata, li wħud minnhom jeżistu f'estratturi awtomatizzati kummerċjali ta 'aċidu nuklejku [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, iċ-Ċina) u Biomek®;Beckman (Miami, l-Istati Uniti).), Florida, USA)].Il-vantaġġi tal-kombinazzjoni ta 'żibeġ manjetiċi ma' mikrofluwidi jistgħu jintużaw għal estrazzjoni awtomatizzata effiċjenti ta 'aċidi nuklejċi, li jistgħu potenzjalment javvanzaw l-iżvilupp ta' dijanjostika molekulari;madankollu, il-kombinazzjoni ta 'żibeġ manjetiċi ma' mikrofluwidi għadha tiddependi ħafna fuq sistemi ta 'kontroll kumplessi għal manipulazzjoni preċiża ta' żibeġ manjetiċi, li jispjega l-popolarità ta 'prodotti kummerċjali li huma goffi u għaljin, li jillimita l-applikazzjoni ulterjuri ta' żibeġ manjetiċi f'POCT.
Diversi materjali porużi bħal filtri tan-nitrocellulose modifikati, kards tal-Finders Technology Associates (FTA), karti tal-filtri bbażati fuq polyethersulfone, u materjali miksija bil-glikan intużaw ukoll għall-iskoperta tal-aċidu nuklejku [40, 41, 42, 43, 44].Materjali fibrużi porużi bħal karta fibruża intużaw għall-ewwel darba biex iżolaw id-DNA billi tħabbil fiżikament molekuli tad-DNA fit-tul b'ħafna fibri.Pori żgħar iwasslu għal restrizzjoni fiżika qawwija tal-molekuli tad-DNA, li taffettwa b'mod pożittiv l-estrazzjoni tad-DNA.Minħabba d-daqsijiet differenti tal-pori tal-karta fibruża, l-effiċjenza tal-estrazzjoni ma tistax tissodisfa l-ħtiġijiet tal-amplifikazzjoni tad-DNA [45, 46].Il-karta FTA hija karta tal-filtru kummerċjali użata fil-qasam tal-mediċina forensika u użata ħafna f'oqsma oħra ta 'dijanjostika molekulari.Permezz ta 'l-użu ta' karta tal-filtru taċ-ċelluloża mimlija b'diversi kimiċi biex lyse l-membrani taċ-ċelluli fil-kampjun, id-DNA rilaxxat huwa protett mid-degradazzjoni sa sentejn.Aktar reċentement, ġiet żviluppata karta taċ-ċelluloża mimlija għal skoperta molekulari ta 'diversi patoġeni, inklużi SARS-CoV-2, leishmaniasis, u malarja [47,48,49].HIV fil-plażma iżolata huwa lysed direttament, u l-aċidu nuklejku virali huwa arrikkit fil-membrana tal-fluss FTA® mibnija fil-konċentratur, li tippermetti produzzjoni effiċjenti tal-aċidu nuklejku [50] (Fig. 2c).Il-problema ewlenija bl-iskoperta tal-aċidu nuklejku bl-użu ta 'karti FTA hija li kimiċi bħal guanidine u isopropanol jinibixxu reazzjonijiet ta' amplifikazzjoni sussegwenti.Biex issolvi din il-problema, żviluppajna l-karta tal-filtru Fusion 5 modifikata bi chitosan, li tgħaqqad il-vantaġġi kemm tal-interlacing fiżiku ta 'molekuli tad-DNA u karta tal-filtru fibruża, kif ukoll l-assorbiment elettrostatiku tad-DNA fuq komposti modifikati bi chitosan biex tinkiseb estrazzjoni ta' aċidu nuklejku effiċjenti ħafna ..fibri tal-filtru [51] (Fig. 2d).Bl-istess mod, Zhu et al.[52] wera metodu PCR modifikat bi chitosan ibbażat fuq sistema mikrofluwidika kapillari in situ għal iżolament rapidu u skoperta tal-RNA tal-virus Zika.L-aċidi nukleiċi jistgħu jiġu adsorbiti/desorbiti f'medja mħallta lisat/PCR, rispettivament, ibbażati fuq il-proprjetà tal-iswiċċ mixgħul/mitfi ta 'chitosan.mixgħul u mitfi”, li jirrispondu għall-pH.
Kif imsemmi hawn fuq, dawn l-istrateġiji jgħaqqdu l-vantaġġi ta 'diversi materjali tal-fażi solida u jżidu l-effiċjenza tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku fil-mikrofluwidi.F'applikazzjonijiet prattiċi, l-użu ta 'dawn il-materjali fi kwantitajiet kbar mhuwiex ekonomiku, u t-trattament xieraq tal-wiċċ jew il-modifika tal-wiċċ ta' materjali komuni b'dawn il-materjali jistgħu wkoll jippreservaw il-funzjoni tagħhom.Għalhekk, huwa maħsub li l-implimentazzjoni ta 'dawn l-istrateġiji wara studju pilota tista' tnaqqas l-ispejjeż.
L-ittestjar tal-aċidu nuklejku fuq pjattaformi mikrofluwidi ħafna drabi juża volumi żgħar ta’ kampjun (< 100 µl), għalhekk jeħtieġ amplifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi fil-mira b’sondi speċifiċi għall-konverżjoni għal sinjal li huwa konvenjenti għal skoperta downstream (ottika, elettrika u manjetika) [53, 54]. L-ittestjar tal-aċidu nuklejku fuq pjattaformi mikrofluwidi ħafna drabi juża volumi żgħar ta’ kampjun (< 100 µl), għalhekk jeħtieġ amplifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi fil-mira b’sondi speċifiċi għall-konverżjoni għal sinjal li huwa konvenjenti għal skoperta downstream (ottika, elettrika u manjetika) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Meta jiġu ttestjati l-aċidi nuklejċi fuq pjattaformi mikrofluwidi, ħafna drabi jintużaw volumi ta 'kampjuni żgħar (<100 µL), għalhekk l-amplifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi fil-mira b'sondi speċjali hija meħtieġa biex tinbidel f'sinjal konvenjenti għal skoperta sussegwenti (ottika, elettrika u manjetika) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 特定 探针 扩增 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 为 便于 下游 下游 检测 检测 （光学 、 、 和 磁学 磁学 磁学）） 的 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 探针 扩增 目标 ， 以 以 转换 为 下游 下游 下游 （光学 光学 、 、 电学 电学 磁学） 的 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Is-sejbien ta' aċidi nuklejċi fuq pjattaformi mikrofluwidi normalment juża volumi ta' kampjuni żgħar (<100 μl), li jeħtieġ amplifikazzjoni ta' aċidi nuklejċi fil-mira b'sondi speċjali biex jaqilbuhom f'sinjali għal skoperta sussegwenti (ottika, elettrika u manjetika) [53, 54]] .L-amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku fil-mikrofluwidi tista 'wkoll tħaffef ir-reazzjonijiet, tottimizza l-limiti ta' skoperta, tnaqqas ir-rekwiżiti tal-kampjuni u ttejjeb l-eżattezza tas-sejbien [55, 56].F'dawn l-aħħar snin, bir-realizzazzjoni ta 'skoperta mgħaġġla u preċiża, ġew applikati diversi metodi ta' amplifikazzjoni ta 'aċidu nuklejku fil-mikrofluwidi, inkluż PCR u xi reazzjonijiet ta' amplifikazzjoni iżotermali.Din it-taqsima se tiġbor fil-qosor metodi għall-iskoperta ta 'aċidu nuklejku bbażati fuq sistemi mikrofluwidi.
PCR hija simulazzjoni tal-proċess ta 'replikazzjoni tad-DNA ta' organiżmu, li t-teorija tiegħu hija deskritta fid-dettall x'imkien ieħor u mhux se tiġi diskussa hawn.Il-PCR jista 'jamplifika ammont żgħir ħafna ta' DNA/RNA fil-mira b'rata esponenzjali, u jagħmel il-PCR għodda qawwija għall-iskoperta rapida ta 'aċidi nuklejċi.F'dawn l-aħħar deċennji, ħafna apparati mikrofluwidi portabbli mgħammra b'sistemi ta 'ċikli termali PCR ġew żviluppati biex jissodisfaw il-ħtiġijiet tad-dijanjostika tal-punt tal-kura [57, 58].On-chip PCR jista 'jinqasam f'erba' tipi (konvenzjonali, fluss kontinwu, spazjalment switched, u convective PCR) skond metodi differenti ta 'kontroll tat-temperatura [59].Per eżempju, Gee et al.[60] żviluppaw metodu ta 'PCR kwantitattiv ta' traskrizzjoni inversa diretta (RT-qPCR) fuq il-pjattaforma mikrofluwidika tagħhom stess għall-iskoperta multiplex ta 'SARS-CoV-2, viruses tal-influwenza A u B f'kampjuni ta' swab tal-griżmejn (Fig. 3a).Park et al.[61] bena ċippa sempliċi ta 'analiżi tal-patoġenu billi integra PCR ta' film irqiq, elettrodi, u modulu mikrofluwidiku mħaddem bis-swaba 'ta' polydimethylsiloxane.Madankollu, iż-żewġ xogħlijiet jinkorporaw in-nuqqasijiet komuni tal-PCR konvenzjonali.Il-PCR jeħtieġ ċikliżmu termali, li jillimita aktar minjaturizzazzjoni tal-apparat u ħin imnaqqas tal-ittestjar.
L-iżvilupp ta 'PCR mikrofluwidiku u spazjali bbażat fuq fluss kontinwu huwa kritiku biex tiġi indirizzata din il-kwistjoni.Bl-użu ta 'kanal serpentin twil jew kanal dritt qasir, PCR ta' fluss kontinwu jista 'jipprovdi amplifikazzjoni mgħaġġla billi jiċċirkola b'mod attiv reaġenti fi tliet żoni ta' tisħin minn qabel b'pompa off-chip.Din l-operazzjoni tevita b'suċċess il-fażi ta 'tranżizzjoni bejn temperaturi ta' reazzjoni differenti u b'hekk tnaqqas b'mod sinifikanti l-ħin tal-ittestjar [62] (Fig. 3b).Fi studju ieħor minn Jung et al.[63] ippropona analizzatur ġenetiku PCR rotatorju ġdid li jgħaqqad il-karatteristiċi ta 'PCR fissi u tal-fluss għal PCR ta' traskrizzjoni inversa ultrafast u multiplex (Fig. 3c).Għall-amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku, il-mikroċipp tal-PCR se jiddawwar permezz ta 'tliet blokki ta' tisħin f'temperaturi differenti: 1. Blokk ta 'denaturazzjoni 94 °C, 2. Blokk ta' ttemprar f'58 °C, 3. Blokk ta 'espansjoni f'72 °C.
Applikazzjoni ta' PCR fil-mikrofluwidi.Rappreżentazzjoni skematika ta 'dirRT-qPCR fuq pjattaforma mikrofluwidika (adattat minn [60]).b Rappreżentazzjoni skematika ta 'mikroarray PCR ta' fluss kontinwu bbażat fuq kanal serpentine (adattat minn [62]).c Rappreżentazzjoni skematika ta' analizzatur ġenetiku PCR li jdur, li jikkonsisti minn mikroċipp, tliet blokki ta' tisħin u mutur stepper (adattat minn [63]).d Dijagramma ta' thermoconvection PCR b'ċentrifugazzjoni u setup (adattat minn [64]).DirRT-qPCR, reazzjoni tal-katina tal-polimerażi tat-traskrizzjoni inversa kwantitattiva diretta
Bl-użu ta 'kapillari u loops jew saħansitra pjanċi rqaq, il-PCR tal-konvezzjoni jista' jamplifika malajr l-aċidi nuklejċi permezz ta 'konvezzjoni termali ħielsa naturali mingħajr il-ħtieġa ta' pompa esterna.Pereżempju, pjattaforma mikrofluidika tal-polimeru tal-olefin ċikliku ġiet żviluppata fuq stadju ta 'tisħin li jdur iffabbrikat li juża ċikliżmu termali b'ċentrifugazzjoni f'mikrokanal PCR loop [64] (Fig. 3d).Is-soluzzjoni ta 'reazzjoni hija mmexxija minn konvezzjoni termali, li kontinwament tiskambja temperatura għolja u baxxa f'mikrokanal bi struttura annulari.Il-proċess kollu ta 'amplifikazzjoni jista' jitlesta f'10 minuti b'limitu ta 'skoperta ta' 70.5 pg/kanal.
Kif mistenni, il-PCR rapida hija għodda b'saħħitha għal sistemi ta 'analiżi molekulari u dijanjostiċi molekulari ta' rispons għal kampjuni kompletament integrati.Rapidu PCR inaqqas b'mod sinifikanti l-ħin meħtieġ biex jinstab SARS-CoV-2, li jikkontribwixxi għall-kontroll effettiv tal-pandemija COVID-19.
Il-PCR jeħtieġ ċiklur termali kumpless li mhuwiex adattat għall-POCT.Aktar reċentement, tekniki ta 'amplifikazzjoni iżotermali ġew applikati għal mikrofluwidi, inklużi iżda mhux limitati għal LAMP, amplifikazzjoni tal-polimerażi recombinase (RPA), u amplifikazzjoni bbażata fuq sekwenzi ta' aċidu nuklejku [65,66,67,68].B'dawn it-tekniki, l-aċidi nuklejċi huma amplifikati f'temperatura kostanti, li jiffaċilitaw il-ħolqien ta 'tagħmir POCT portabbli bi prezz baxx u sensittiv ħafna għal dijanjostika molekulari.
Assaġġi tal-LAMP bbażati fuq mikrofluwidi ta 'rendiment għoli jippermettu skoperta multipla ta' mard infettiv [42, 69, 70, 71].Flimkien ma 'sistema mikrofluwidi ċentrifugali, LAMP jista' jiffaċilita aktar l-awtomazzjoni tas-sejbien ta 'aċidu nuklejku [69, 72, 73, 74, 75].Is-SlipChip spin-and-react ġie żviluppat għall-iskoperta viżwali ta 'batterji paralleli multipli bl-użu ta' LAMP [76] (Fig. 4a).Meta tuża LAMP ottimizzata fl-assaġġ, il-proporzjon tas-sinjal tal-fluworexxenza għall-istorbju kien ta 'madwar 5 darbiet, u l-limitu ta' skoperta laħaq 7.2 kopji / μl ta 'DNA ġenomika. Barra minn hekk, l-eżistenza ta 'ħames patoġeni batterjali diġestivi komuni, inklużi Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis u Vibrio parahaemolyticus, ġew viżwalizzati abbażi tal-metodu f'< 60 min. Barra minn hekk, l-eżistenza ta 'ħames patoġeni batterjali diġestivi komuni, inklużi Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis u Vibrio parahaemolyticus, ġew viżwalizzati abbażi tal-metodu f'< 60 min.Barra minn hekk, il-preżenza ta 'ħames patoġeni batterjali komuni tas-sistema diġestiva, inklużi Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis u Vibrio parahaemolyticus, ġiet viżwalizzata bl-użu ta' dan il-metodu f'inqas minn 60 minuta.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 种 消化道 细菌病 细菌病 原体 的 存在 ， ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 肠杆菌 、 、 肠 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 和 副溶血性 副溶血性 弧菌此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 存在 ， 包括 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 氏 菌 菌 、 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPBarra minn hekk, il-preżenza ta 'ħames patoġeni gastrointestinali batterjali komuni, inklużi Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius, u Vibrio parahaemolyticus, ġiet viżwalizzata bl-użu ta' dan il-metodu f'inqas minn 60 minuta.
Il-vantaġġi tal-LAMP fil-mikrofluwidi jinkludu, fost oħrajn, rispons mgħaġġel u skoperta minjaturizzata.Madankollu, minħabba t-temperatura ta 'reazzjoni (madwar 70 ° C), aerosols huma inevitabbilment iġġenerat waqt LAMP, li jirriżulta f'rata pożittiva falza għolja.L-ispeċifiċità tal-assaġġ, id-disinn tal-primer, u l-kontroll tat-temperatura jeħtieġ ukoll li jiġu ottimizzati għal LAMP.Barra minn hekk, disinji ta 'ċippa li jimplimentaw skoperta ta' mira multipli fuq ċippa waħda huma ta 'valur kbir u għandhom jiġu żviluppati.Barra minn hekk, LAMP huwa adattat għal skoperta multi-purpose integrata f'ċippa waħda, li hija ta 'importanza kbira, iżda għad hemm ħafna spazju għall-iżvilupp.
Ir-rata pożittiva falza għolja ta 'LAMP tista' titnaqqas parzjalment bl-RPA, peress li t-temperatura ta 'reazzjoni relattivament baxxa (~ 37 °C) tirriżulta fi relattivament ftit problemi ta' evaporazzjoni [77].Fis-sistema RPA, żewġ primers opposti jibdew is-sinteżi tad-DNA billi jorbtu ma 'recombinase u l-amplifikazzjoni tista' titlesta fi żmien 10 minuti [78,79,80,81].Għalhekk, il-proċess RPA kollu huwa ħafna aktar mgħaġġel minn PCR jew LAMP.F'dawn l-aħħar snin, intweriet li t-teknoloġija mikrofluwidika tkompli ttejjeb il-veloċità u l-eżattezza tal-RPA [82,83,84].Per eżempju, Liu et al.[85] żviluppaw assaġġ ta 'amplifikazzjoni tal-polimerażi recombinase tal-fluss laterali integrat mikrofluwidiku għal sejbien rapidu u sensittiv ta' SARS-CoV-2 billi jintegraw traskrizzjoni inversa RPA (RT-RPA) u sistema ta 'skoperta ta' strixxi tat-test tal-fluss laterali universali.f'sistema mikrofluwidika waħda.Figura 4b).Il-limitu ta 'skoperta huwa kopja 1/µl jew 30 kopja/kampjun, u l-iskoperta tista' titlesta f'madwar 30 minuta.Kong et al.żviluppaw apparat mikrofluwidi li jintlibes.[86] uża t-temperatura tal-ġisem u sistema ta' skoperta ta' fluworexxenza bbażata fuq it-telefon ċellulari biex tiskopri malajr u direttament id-DNA tal-HIV-1 bl-użu tal-RPA (Figura 4c).L-assaġġ RPA li jintlibes jiskopri 100 kopja/mL tas-sekwenza fil-mira fi żmien 24 minuta, li juri potenzjal kbir għal dijanjosi rapida ta 'trabi infettati bl-HIV-1 f'ambjenti limitati bir-riżorsi.
Amplifikazzjoni iżotermika fl-ittestjar tal-punt tal-kura (POCT).Żvilupp u produzzjoni ta 'spin u reazzjoni SlipChip.Wara l-iwweldjar tal-plażma, iċ-ċipep ta 'fuq u ta' isfel ġew immuntati b'sett ta 'ġewż biex jiffurmaw iċ-ċippa finali (adattat minn [76]).b Skematika tas-sistema MI-IF-RPA għall-iskoperta tal-COVID-19 (adattat minn [85]).c Skematika ta' test tal-RPA li jintlibes għal skoperta rapida tad-DNA tal-HIV-1 (adattat minn [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, virus tal-immunodefiċjenza umana HIV, RPA recombinase polymerase amplifikazzjoni, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Integrated Microfluteraldic Polymerase FRM Amplifikazzjoni
RPA ibbażat fuq mikrofluwidi qed jiżviluppa malajr, madankollu, l-ispiża tal-fabbrikazzjoni taċ-ċippa u l-konsum tar-reazzjoni hija għolja wisq u għandha titnaqqas biex tiżdied id-disponibbiltà ta 'din it-teknoloġija.Barra minn hekk, is-sensittività għolja ta 'RPA tista' taffettwa l-amplifikazzjoni ta 'prodotti mhux speċifiċi, speċjalment fil-preżenza ta' kontaminazzjoni.Dawn il-limitazzjonijiet jistgħu jaffettwaw l-applikazzjoni ta 'RPA f'sistemi mikrofluwidi u jistħoqqilhom ottimizzazzjoni ulterjuri.Primers u sondi ddisinjati tajjeb għal diversi miri huma wkoll meħtieġa biex itejbu l-fattibilità ta 'strateġiji mikrofluwidi bbażati fuq RPA fil-POCT.
Cas13 u Cas12a għandhom il-kapaċità li jaqtgħu l-aċidi nuklejċi b'mod każwali u għalhekk jistgħu jiġu żviluppati bħala għodod ta 'skoperta u dijanjostiċi.Cas13 u Cas12a huma attivati malli jorbtu ma' DNA jew RNA fil-mira, rispettivament.Ladarba tiġi attivata, il-proteina tibda taqsam aċidi nuklejċi oħra fil-qrib, u wara RNAs gwida li jimmiraw aċidi nuklejċi speċifiċi għall-patoġenu jistgħu jaqsmu sondi fluworexxenti mitfija u jirrilaxxaw fluworexxenza.Ibbażat fuq din it-teorija, Kellner et al.[87] żviluppaw metodu bbażat fuq Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], u Broughton et al.[88] żviluppaw approċċ ieħor ibbażat fuq Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
F'dawn l-aħħar snin, dehru diversi metodi għall-iskoperta ta 'aċidi nuklejċi bbażati fuq CRISPR [89, 90].Metodi konvenzjonali bbażati fuq CRISPR ħafna drabi jieħdu ħafna ħin u jaħdmu ħafna minħabba proċeduri multipli inklużi l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, l-amplifikazzjoni u l-iskoperta ta’ CRISPR.L-espożizzjoni ta' likwidi għall-arja tista' żżid iċ-ċans ta' riżultati pożittivi foloz.Minħabba dan ta 'hawn fuq, is-sistemi bbażati fuq CRISPR huma fil-bżonn kbir ta' ottimizzazzjoni.
Pjattaforma mikrofluwidika kkontrollata pnewmatikament li tista 'twettaq 24 analiżi b'mod parallel ġiet żviluppata għal applikazzjonijiet ta' skoperta CRISPR-Cas12a u CRISPR-Cas13a [91].Is-sistema hija mgħammra b'apparat ta 'skoperta tal-fluworexxenza li jevita l-amplifikazzjoni tal-aċidu nuklejku u awtomatikament jiskopri kampjuni ta' DNA u RNA femtomolar.Chen et al.[92] amplifikazzjoni rikombinase integrata mas-sistema CRISPR-Cas12a f'mikrofluwidi ċentrifugali (Fig. 5a).Dan ix-xogħol jegħleb id-diffikultà li jiġu integrati dawn iż-żewġ proċessi minħabba li Cas12a jista 'jiddiġerixxi d-DNA tal-messaġġier u jinibixxi l-proċess ta' amplifikazzjoni.Barra minn hekk, Chen et al.[92] barra minn hekk ħażnu minn qabel ir-reaġenti tar-reazzjoni f'kontroll mikrofluwidi ċentrifugali biex awtomatikament jitlesta l-proċess kollu.F'xogħol ieħor, Silva et al.[93] żviluppaw metodu dijanjostiku mingħajr amplifikazzjoni CRISPR/Cas12a u smartphone biex tiskopri SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Dan l-assaġġ, magħruf bħala sistema mingħajr amplifikazzjoni bbażata fuq it-telefon ċellulari, jinkludi enzima CRISPR/Cas dipendenti li hija bbażata fuq viżwalizzazzjoni smartphone ta 'sinjali tal-bużżieqa ġenerati mill-catalase f'kanali mikrofluwidi.Sejbien sensittiv ta 'inqas minn 50 kopja/µl ta' aċidu nuklejku mingħajr amplifikazzjoni minn qabel, il-proċess kollu mill-injezzjoni tal-kampjun sal-qari tas-sinjal jieħu biss 71 minuta.
Metodi ta' skoperta ta' aċidu nuklejku bbażati fuq CRISPR.POCT ċentrifugali għal dijanjostika molekulari integrata bbażata fuq CRISPR (adattat minn [92]).b Żvilupp tat-test CASCADE għal analiżi bbażata fuq smartphone tas-SARS-CoV-2 (adattat minn [93]).Amplifikazzjoni RAA recombinase, motif protospacer maġenb PAM, repetizzjonijiet palindromic qosra miġbura CRISPR f'intervalli regolari, sistema CASCADE mingħajr amplifikazzjoni tat-telefon ċellulari b'enzimi CRISPR/CAS dipendenti, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride EDC
Bħala l-aħħar pass fl-iskoperta tal-aċidu nuklejku, l-iskoperta tas-sinjali tirrifletti direttament ir-riżultati dijanjostiċi u hija fattur kritiku fl-iżvilupp ta 'POCT effiċjenti, sensittiv u preċiż.Is-sinjali jistgħu jinqraw bl-użu ta 'metodi varji bħal strateġiji fluworexxenti, elettrokimiċi, kolorimetriċi u manjetiċi.F'din it-taqsima, niddeskrivu r-raġunament għal kull approċċ u nqabblu d-dijanjostika molekulari ta 'mard infettiv fil-mikrofluwidi.
Strateġiji bbażati fuq il-fluworexxenza jintużaw ħafna għad-dijanjostika POCT ta 'mard infettiv minħabba l-vantaġġi notevoli tagħhom ta' sensittività eċċellenti, spiża baxxa, faċilità ta 'tħaddim u analiżi tal-punt tal-kura [94, 95].Dawn l-istrateġiji jużaw fluworofori ttikkettjati bħal żebgħat fluworexxenti u nanomaterjali biex joħolqu sinjal li jista 'jinqabad (titjib jew tkessiħ tal-fluworexxenza).Din is-sejba tissuġġerixxi li l-istrateġiji bbażati fuq il-fluworexxenza jistgħu jinqasmu f'tikkettjar fluworexxenti dirett, sinjal mixgħul, u skoperta fluworexxenti sinjal off [96].L-iskoperta diretta tat-tikketta fluworexxenti tuża tikketti fluworexxenti speċjali biex tittikkettja ligandi speċifiċi li jiġġeneraw ammont speċifiku ta 'fluworexxenza meta jintrabat b'mod selettiv ma' mira.Għall-iskoperta tal-fluworexxenza bbażata fuq is-sinjal, il-kwalità tas-sinjal fluworexxenti hija relatata b'mod pożittiv mal-kobor tal-interess.L-intensità tal-fluworexxenza hija negliġibbli fin-nuqqas ta' mira u hija skoperta meta jkun preżenti ammont suffiċjenti ta' mira.Bil-maqlub, l-intensità tal-fluworexxenza misjuba minn fluworexxenza "sinjal off" hija inversament proporzjonali għall-ammont ta 'mira, inizjalment tilħaq valur massimu u tonqos gradwalment hekk kif il-mira hija mkabbra.Pereżempju, bl-użu tal-mekkaniżmu ta 'trans-cleavage dipendenti mill-mira CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] żviluppaw strateġija ġdida ta 'rikonoxximent biex tiskopri RNAs li jevitaw it-traskrizzjoni inversa direttament (Fig. 6a).Malli jorbot ma' RNAs fil-mira komplementari, il-kumpless CRISPR-Cas13-RNA jista 'jiġi attivat, u jwassal għal qsim transkollaterali minn RNAs reporter mhux speċifiċi.Ir-reporter ittikkettjat b'mod fluworexxenti [fluorophore (F)] huwa mitfi mill-quencher (Q) intatt u jiffluworexxenti meta jinqasam mill-kumpless attivat.
Il-vantaġġ tas-sejbien elettrokimiku huwa veloċità għolja ta 'skoperta, produzzjoni faċli, prezz baxx, faċli biex iġorr u kontroll awtomatiku.Huwa metodu analitiku qawwi għall-applikazzjonijiet POCT.Ibbażat fuq transistors b'effett ta 'kamp tal-grafene Gao et al.[98] żviluppaw nanobiosensor għall-iskoperta multiplex ta 'antiġeni tal-marda ta' Lyme minn batterji Borrelia burgdorferi b'limitu ta 'skoperta ta' 2 pg/mL (Fig. 6b).
Assays kolorimetriċi ntużaw f'applikazzjonijiet POCT, li jibbenefikaw mill-vantaġġi tal-portabbiltà, spiża baxxa, faċilità ta 'preparazzjoni, u qari viżwali.L-iskoperta koloremetrika tista 'tuża l-ossidazzjoni ta' peroxidase jew nanomaterjali bħal peroxidase, l-aggregazzjoni ta 'nanomaterjali, u ż-żieda ta' żebgħa indikaturi biex tikkonverti informazzjoni dwar il-preżenza ta 'aċidi nuklejċi fil-mira f'bidliet viżibbli tal-kulur [99, 100, 101].Notevolment, in-nanopartiċelli tad-deheb jintużaw ħafna fl-iżvilupp ta 'strateġiji kolorimetriċi, u minħabba l-kapaċità tagħhom li jinduċu bidliet rapidi u sinifikanti fil-kulur, hemm interess dejjem akbar fl-iżvilupp ta' pjattaformi kolorimetriċi POCT għal dijanjosi in situ ta 'mard infettiv [102].B'apparat mikrofluwidi ċentrifugali integrat [103], patoġeni li jinġarru mill-ikel f'kampjuni ta 'ħalib ikkontaminat jistgħu jiġu skoperti awtomatikament fil-livell ta' 10 ċelluli batterjali, u r-riżultati jistgħu jinqraw viżwalment fi żmien 65 minuta (Fig. 6c).
Tekniki ta 'sensing manjetiku jistgħu jiskopru b'mod preċiż l-analiti bl-użu ta' materjali manjetiċi, u kien hemm interess sinifikanti fl-applikazzjonijiet POCT f'dawn l-aħħar deċennji.Tekniki ta 'sensing manjetiku għandhom xi vantaġġi uniċi bħal materjali manjetiċi bi prezz baxx aktar milli komponenti ottiċi għaljin.Madankollu, l-użu ta 'kamp manjetiku jtejjeb l-effiċjenza tas-sejbien u jnaqqas il-ħin tal-preparazzjoni tal-kampjun [104].Barra minn hekk, ir-riżultati ta 'sondar manjetiku juru speċifiċità għolja, sensittività, u proporzjon għoli ta' sinjal għall-istorbju minħabba s-sinjal manjetiku insinifikanti fl-isfond ta 'kampjuni bijoloġiċi [105].Sharma et al.integrat bijosensor ibbażat fuq junction ta 'mina manjetika fi pjattaforma ta' mikroċipp portabbli.[106] għal skoperta multiplex ta 'patoġeni (Fig. 6d).Biosensors jiskopru b'mod sensittiv aċidi nuklejċi subnanomolari iżolati minn patoġeni.
Metodu tipiku ta 'skoperta tas-sinjali.Il-kunċett ta 'sejbien iperlokalizzat ta' Cas13a (adattat minn [97]).b Nanobiosensor tal-Graphene FET flimkien ma' Lyme GroES scFv (adattat minn [98]).c Indikazzjonijiet kolorimetriċi għal skoperta multiplex ta' patoġeni li jinġarru mill-ikel f'ċippa mikrofluwidi ċentrifugali: kampjuni Nru 1 u Nru 3 b'patoġeni fil-mira, u kampjuni Nru 2, Nru 4 u Nru 5 mingħajr patoġeni fil-mira (adattati minn [103]) .d Biosensor ibbażat fuq junction ta’ mina manjetika, inkluża pjattaforma, amplifikatur li jimblokka integrat, unità ta’ kontroll, u provvista ta’ enerġija għall-ġenerazzjoni/akkwist tas-sinjali (adattat minn [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
Minkejja l-karatteristiċi eċċellenti tal-metodi ta 'skoperta ta' hawn fuq, xorta għandhom żvantaġġi.Dawn il-metodi huma mqabbla (tabella 1), inklużi xi applikazzjonijiet b'dettalji (vantaġġi u liżvantaġġi).
Bl-iżvilupp ta 'mikrofluwidi, sistemi mikroelettromekkaniċi, nanoteknoloġija u xjenza tal-materjali, l-użu ta' ċipep mikrofluwidi għall-iskoperta ta 'mard infettiv qed javvanza kontinwament [55,96,107,108].Manipulazzjoni preċiża ta 'tagħmir minjatura u fluwidi tikkontribwixxi għall-eżattezza dijanjostika u l-kosteffettività.Għalhekk, għal aktar żvilupp, saru sforzi biex jiġu ottimizzati u aġġornati ċ-ċipep, li jirriżultaw f'diversi ċipep mikrofluwidi bi strutturi u funzjonijiet differenti.Hawnhekk nintroduċu fil-qosor diversi tipi komuni ta 'pjattaformi mikrofluwidi u nqabblu l-karatteristiċi tagħhom (vantaġġi u liżvantaġġi).Barra minn hekk, ħafna mill-eżempji elenkati hawn taħt jiffokaw primarjament fuq il-ġlieda kontra s-SARS-CoV-2.
LOCCs huma l-aktar sistemi analitiċi kumplessi minjaturizzati komuni u l-operazzjonijiet tagħhom huma minjaturizzati ħafna, integrati, awtomatizzati u parallelizzati mill-injezzjoni u l-preparazzjoni tal-kampjun, il-kontroll tal-fluss u l-iskoperta tal-likwidu [109, 110].Il-likwidi huma manipulati permezz ta 'ġeometrija ddisinjata bir-reqqa u l-interazzjoni ta' ħafna effetti fiżiċi bħal gradjenti ta 'pressjoni, azzjoni kapillari, elettrodinamika, kampijiet manjetiċi u mewġ akustiku [111].LOCC juri vantaġġi eċċellenti fl-iskrinjar ta 'veloċità għolja u skoperta multipla, b'veloċità ta' analiżi mgħaġġla, daqs żgħir tal-kampjun, konsum baxx ta 'enerġija, u effiċjenza għolja ta' ġestjoni u tħaddim;madankollu, l-apparati LOCC huma delikati ħafna, u l-manifattura, l-ippakkjar, u l-interfacing.Madankollu, il-multiplexing u l-użu mill-ġdid jiffaċċjaw diffikultajiet enormi [96].Meta mqabbel ma 'pjattaformi oħra, LOCC għandu vantaġġi uniċi f'termini ta' diversità massima ta 'applikazzjoni u l-aħjar kompatibilità tat-teknoloġija, iżda l-iżvantaġġi tiegħu huma wkoll ovvji, jiġifieri kumplessità għolja u ripetibbiltà fqira.Id-dipendenza fuq pompi esterni, li ħafna drabi huma goffi u għaljin, tillimita aktar l-użu tagħhom fil-POCT.
Matul it-tifqigħa tal-COVID-19, LOCC irċieva ħafna attenzjoni.Fl-istess ħin, hemm diversi ċipep ġodda li jgħaqqdu diversi teknoloġiji.Pereżempju, l-ismartphones issa jintużaw ħafna bħala apparat analitiku portabbli u għandhom potenzjal kbir għall-integrazzjoni LOCC.Sun et al.[21] iffabbrika ċippa mikrofluwidika li tippermetti l-multiplexing ta’ sekwenzi speċifiċi ta’ aċidu nuklejku ta’ ħames patoġeni, inkluż SARS-CoV-2, bl-użu ta’ LAMP u analizzathom bl-użu ta’ smartphone fi żmien siegħa wara t-tmiem tar-reazzjoni.Bħala eżempju ieħor, Sundah et al.[112] ħoloq swiċċ molekulari [amplifikazzjoni katalitika permezz ta' swiċċ ta' stat ta' transizzjoni molekulari (CATCH)] għal skoperta diretta u sensittiva ta' miri ta' SARS-CoV-2 RNA bl-użu ta' smartphones. CATCH huwa kompatibbli ma' LOCC portabbli u jikseb prestazzjoni superjuri (madwar 8 kopji RNA/μl; < 1 siegħa f'temperatura tal-kamra) [112]. CATCH huwa kompatibbli ma' LOCC portabbli u jikseb prestazzjoni superjuri (madwar 8 kopji RNA/μl; < 1 siegħa f'temperatura tal-kamra) [112]. Qabda совместим с пerrтатативны locc и обеспечивает превосходную xitat п п п п п п п п п п. CATCH huwa kompatibbli ma' LOCC portabbli u jipprovdi throughput eċċellenti (madwar 8 kopji RNA/µl; < 1 siegħa f'temperatura tal-kamra) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 Qabda совместим с портатативныи locc и обладает превосходной производительностюю (п п р п п. CATCH huwa kompatibbli ma' LOCCs portabbli u għandu prestazzjoni eċċellenti (madwar 8 kopji RNA/µl; < siegħa f'temperatura tal-kamra) [112].Barra minn hekk, l-apparati LOCC għad-dijanjostika molekulari jużaw ukoll xi forzi tas-sewqan bħal vakwu, stretch, u kampijiet elettriċi.Kang et al.[113] wera PCR tan-nanoplasma-on-a-chip ultra-veloċi f'ħin reali għal dijanjosi rapida u kwantitattiva ta' COVID-19 fil-qasam bl-użu ta' ċippa tal-PCR likwidu plasmoniku vakwu.Li et al.[114] sussegwentement żviluppaw ċippa mikrofluwidika mmexxija minn stretch li ppermettiet id-dijanjosi tal-COVID-19.Il-pjattaforma tuża s-sistema ta 'amplifikazzjoni RT-LAMP biex tiddetermina jekk kampjun huwiex kwalitattivament pożittiv jew negattiv.Sussegwentement, Ramachandran et al.[115] kisbu gradjenti xierqa ta 'kamp elettriku bl-użu ta' isotachophoresis (ITP), teknika selettiva li tiffoka joni implimentata fil-mikrofluwidi.B'ITP, l-RNA fil-mira minn kampjuni ta 'tampuni nażofarinġi nejjin jistgħu jiġu purifikati awtomatikament.Imbagħad Ramachandran et al.[115] Meta tgħaqqad din il-purifikazzjoni ITP ma 'LAMP mtejba bl-ITP u analiżi CRISPR skoprew SARS-CoV-2 f'tampuni nażofarinġi umani u kampjuni kliniċi f'madwar 35 minuta.Barra minn hekk, ideat ġodda qed joħorġu kontinwament.Jadhav et al.[116] ippropona skema dijanjostika bbażata fuq spettroskopija Raman mtejba fil-wiċċ flimkien ma' apparat mikrofluwidi li fih jew nanotubi tal-karbonju miksijin bil-fidda tad-deheb/fidda orjentati vertikalment jew mikro/nanotubi elettrospun li jintremew.Il-mikrokanali tal-filtri integrati li jiffunzjonaw bil-membrana jintremew.L-apparat jassorbi viruses minn diversi fluwidi/exudations tal-ġisem bħal bżieq, nasofarinġi u tiċrit.Għalhekk, it-titer tal-virus huwa abbundanti u l-virus jista 'jiġi identifikat b'mod preċiż mill-firma Raman.
LOAD hija pjattaforma mikrofluwidi ċentrifugali li fiha l-proċessi kollha huma kkontrollati minn protokoll ta 'frekwenza li jdur sottostrat mikrostrutturat [110].L-apparat TAGĦBIJA huwa kkaratterizzat billi juża forza ċentrifugali bħala forza importanti li tmexxi.Il-likwidi huma wkoll soġġetti għal forzi kapillari, Euler u Coriolis.Bl-użu ta 'apparat ċentrifugu, l-analiżi huma mwettqa f'operazzjoni likwidu kontinwu minn pożizzjoni radjali 'l ġewwa għal barra, li jeliminaw il-ħtieġa għal tubi esterni addizzjonali, pompi, attwaturi, u valvi attivi.Fil-qosor, metodu ta 'kontroll wieħed jissimplifika l-operat.Il-forzi li jaġixxu fuq il-likwidu fl-istess kanal mikrofluwidi fl-istess distanza miċ-ċentru tat-tagħbija huma ugwali, li jagħmilha possibbli li tirrepeti l-istruttura tal-kanal.Għalhekk, it-tagħmir LOAD huwa aktar sempliċi u aktar ekonomiku għad-disinn u l-manifattura minn tagħmir LOCC konvenzjonali, filwaqt li r-reazzjonijiet huma fil-biċċa l-kbira indipendenti u parallelizzati;madankollu, minħabba s-saħħa mekkanika għolja tat-tagħmir ċentrifugali, il-materjal taċ-ċippa disponibbli huwa limitat u volumi żgħar huma diffiċli.lejn il-karozza.Fl-istess ħin, il-biċċa l-kbira tat-tagħmir LOAD huma ddisinjati għal użu wieħed biss, li jiswa ħafna flus għal skoperta fuq skala kbira [96, 117, 118, 119].
F'dawn l-aħħar deċennji, LOAD, meqjus bħala wieħed mill-aktar apparati mikrofluwidi promettenti, irċieva attenzjoni konsiderevoli minn riċerkaturi u manifatturi.Għalhekk, LOAD kisbet aċċettazzjoni wiesgħa u ntużat għal dijanjostika molekulari ta 'patoġeni infettivi [120, 121, 122, 123, 124], speċjalment waqt it-tifqigħa ta' COVID-19.Pereżempju, fl-aħħar tal-2020, Ji et al.[60] wera analiżi diretta RT-qPCR għal skoperta parallela rapida u awtomatizzata ta' infezzjonijiet ta' SARS-CoV-2 u influwenza A u B f'kampjuni tat-tampuni tal-griżmejn.Imbagħad Xiong et al.[74] ippreżenta pjattaforma mikrofluwidika discoid integrata bil-LAMP għal skoperta rapida, preċiża u simultanja ta’ seba’ koronavirus respiratorji umani, inkluż SARS-CoV-2, fi żmien 40 minuta.Fil-bidu tal-2021, de Oliveira et al.[73] wera ċippa mikrofluwidika ċentrifugali ta' toner tal-polistirene, imħaddma manwalment b'rotazzjoni tas-swaba', għal dijanjosi molekulari RT-LAMP ta' COVID-19.Sussegwentement, Dignan et al.[39] ippreżenta mikroapparat ċentrifugu portabbli awtomatizzat għall-purifikazzjoni ta 'SARS-CoV-2 RNA direttament minn sezzjonijiet ta' swab buccal.Medved et al.[53] ippropona sistema ta’ kampjunar ta’ aerosol SARS-CoV-2 inline b’ċippa fluworexxenti mikrofluwidika li ddur ta’ volum żgħir b’limitu ta’ skoperta ta’ 10 kopji/μL u limitu minimu taċ-ċiklu ta’ 15-il minuta.Suarez et al.[75] reċentement irrapporta l-iżvilupp ta 'pjattaforma mikrofluwidika ċentrifugali modulari integrata għall-iskoperta diretta ta' SARS-CoV-2 RNA f'kampjuni ta 'tampuni nasofarinġi inattivati bis-sħana bl-użu ta' LAMP.Dawn l-eżempji juru l-benefiċċji kbar u l-wegħda ta’ LOAD fid-dijanjostika molekulari ta’ COVID-19.
Fl-1945 Muller u Clegg [125] ippreżentaw l-ewwel kanali mikrofluwidi fuq il-karta bl-użu tal-karta tal-filtru u l-paraffin.Fl-2007, il-grupp Whitesides [126] ħoloq l-ewwel pjattaforma tal-karti funzjonali għall-ittestjar tal-proteini u l-glukożju.Il-karta saret sottostrat ideali għall-mikrofluwidi.Il-karta għandha proprjetajiet inerenti bħal idrofiliċità u struttura poruża, bijokompatibilità eċċellenti, piż ħafif, flessibilità, jintwew, prezz baxx, faċilità ta 'użu u konvenjenza.Il-µPADs klassiċi jikkonsistu fi strutturi idrofiliċi/idrofobiċi mibnija fuq sottostrati tal-karti.Skont l-istruttura tridimensjonali, il-μPADs jistgħu jinqasmu f'μPADs bidimensjonali (2D) u tridimensjonali (3D).Il-µPADs 2D huma prodotti billi jiffurmaw konfini idrofobiċi biex jiffurmaw kanali mikrofluwidi, filwaqt li l-µPADs 3D huma ġeneralment magħmula minn munzelli ta’ saffi ta’ karta mikrofluwidi 2D, xi kultant permezz ta’ tiwi tal-karta, tekniki ta’ żlieq, kanali miftuħa u stampar 3D [96].Fluwidi milwiema jew bijoloġiċi fuq il-μPAD huma primarjament ikkontrollati minn forza kapillari mingħajr sors ta 'enerġija esterna, li jiffaċilita l-ħażna minn qabel tar-reaġenti, l-immaniġġjar tal-kampjuni u l-iskoperta multiplex.Madankollu, kontroll preċiż tal-fluss u skoperta multiplex huma mxekkla minn veloċità ta 'skoperta insuffiċjenti, sensittività u użu mill-ġdid [96, 127, 128, 129, 130].
Bħala pjattaforma mikrofluwidika mhux tas-soltu, μPAD ġie promoss u żviluppat b'mod wiesa 'għall-dijanjosi molekulari ta' mard infettiv bħal HCV, HIV, u SARS-CoV-2 [131, 132].Għal sejbien selettiv u sensittiv ta 'HCV, Tengam et al.[133] żviluppaw bijosensur ġdid ibbażat fuq karta fluworexxenti bl-użu ta 'sonda ta' aċidu nuklejku speċifika ħafna bbażata fuq peptide pyrrolidinyl.L-aċidi nukleiċi huma immobilizzati b'mod kovalenti fuq karta taċ-ċelluloża parzjalment ossidizzata permezz ta 'alkilazzjoni riduttiva bejn gruppi amminiċi u gruppi aldehyde, u l-iskoperta hija bbażata fuq fluworexxenza.Dawn is-sinjali jistgħu jinqraw minn gadget magħmul apposta b'kamera fluworexxenti portabbli flimkien ma 'kamera tat-telefon ċellulari.Sussegwentement, Lu et al.[134] iddisinjat elettrodu flessibbli bbażat fuq il-karta bbażat fuq kompożiti ta' qafas organometalliku tan-nikil/deheb/nanotubi tad-deheb/nanotubi tal-karbonju għall-iskoperta tal-mira tal-HIV permezz tal-ibridizzazzjoni tad-DNA bl-użu tal-blu tal-metilin bħala indikatur redox tad-DNA.Aktar reċentement, Chowdury et al.[135] ippreżenta disinn ipotetiku ta’ pjattaforma għall-ittestjar tal-µPAD fil-punt tal-kura bl-użu tal-bżieq mhux ipproċessat tal-pazjent flimkien ma’ LAMP u teknoloġija tal-immaġini portabbli għall-iskoperta tal-analite COVID-19.
It-testijiet tal-fluss laterali jiggwidaw il-fluwidi bil-forzi kapillari u jikkontrollaw il-moviment tal-fluwidu permezz tat-tixrib u l-karatteristiċi ta 'sottostrati porużi jew mikrostrutturati.L-apparati tal-fluss laterali jikkonsistu f'kampjun, konjugat, inkubatur u skoperta, u pads assorbenti.Il-molekuli tal-aċidu nuklejku fl-LFA jirrikonoxxu sustanzi li jgħaqqdu speċifiċi li huma maħżuna minn qabel fis-sit tal-irbit u jorbtu bħala kumplessi.Hekk kif il-likwidu jgħaddi mill-pjanċi ta 'inkubazzjoni u skoperta, il-kumplessi jinqabdu mill-molekuli tal-qbid li jinsabu fuq il-linji tat-test u l-kontroll, li juru riżultati li jistgħu jinqraw direttament mal-għajn.Tipikament, LFA jista 'jitlesta fi 2-15-il minuta, li huwa aktar mgħaġġel minn skoperta tradizzjonali.Minħabba l-mekkaniżmu speċjali, LFA teħtieġ ftit operazzjonijiet u ma teħtieġx tagħmir addizzjonali, li jagħmilha faċli ħafna għall-utent.Huwa faċli li timmanifattura u timminjaturizza, u l-ispiża tas-sottostrati bbażati fuq il-karta hija aktar baxxa.Madankollu, huwa użat biss għal analiżi kwalitattiva, u l-iskoperta kwantitattiva hija diffiċli ħafna, u l-abbiltà tal-multiplexing u t-throughput huma limitati ħafna, u aċidu nuklejku suffiċjenti wieħed biss jista 'jiġi skopert kull darba [96,110,127].
Għalkemm il-biċċa l-kbira tal-applikazzjonijiet tal-LFA huma ffukati fuq immunoassays, l-użu tal-LFA għal dijanjostika molekulari f'ċipep mikrofluwidi huwa wkoll effettiv u popolari [136].Fil-każ tal-virus tal-epatite B, HIV u SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] ippropona pjattaforma LFA tan-nanopartiċelli ta 'konverżjoni 'l fuq u wriet il-versatilità ta' din il-pjattaforma minjaturizzata u portabbli permezz ta 'skoperta sensittiva u kwantitattiva ta' miri multipli bħall-aċidu nuklejku HBV.Barra minn hekk, Fu et al.[138] wera LFA ġdid ibbażat fuq spettroskopija Raman imsaħħa fil-wiċċ għall-analiżi kwantitattiva tad-DNA tal-HIV-1 f'konċentrazzjonijiet baxxi.Għal sejbien rapidu u sensittiv ta 'SARS-CoV-2, Liu et al.[85] żviluppaw analiżi tal-fluss laterali RPA integrata b'mikrofluwidi billi għaqqad RT-RPA u sistema ta 'skoperta tal-fluss laterali universali f'sistema mikrofluwidika waħda.
L-applikazzjoni ta 'diversi pjattaformi mikrofluwidi tvarja skont studji speċifiċi, billi tieħu vantaġġ sħiħ mill-kapaċitajiet u l-vantaġġi tal-pjattaformi.B'valvi, pompi u kanali affordabbli, LOCC hija l-aktar pjattaforma komprensiva għad-diversità tal-applikazzjoni u l-interoperabbiltà bl-akbar spazju għall-iżvilupp.Għalhekk, nittamaw u nirrakkomandaw li l-aktar studji ġodda jsiru fil-LOCC bħala l-ewwel tentattiv u li l-kundizzjonijiet jiġu ottimizzati.Barra minn hekk, metodi aktar effiċjenti u preċiżi huma mistennija li jiġu skoperti u użati fis-sistema.TAGĦBIJA jeċċella fil-kontroll preċiż tal-fluwidi minn apparat LOCC eżistenti u juri vantaġġi uniċi f'drives singolu b'forza ċentrifugali mingħajr il-ħtieġa għal drives esterni, filwaqt li r-risponsi paralleli jistgħu jkunu separati u sinkronizzati.Għalhekk, fil-futur, LOAD se ssir il-pjattaforma mikrofluwidika ewlenija b'inqas operazzjonijiet manwali u teknoloġiji aktar maturi u awtomatizzati.Il-pjattaforma µPAD tgħaqqad il-benefiċċji ta’ LOCC u materjali bbażati fuq il-karta għal dijanjostiċi ta’ użu ta’ darba b’kost baxx.Għalhekk, l-iżvilupp futur għandu jiffoka fuq teknoloġiji konvenjenti u stabbiliti sew.Barra minn hekk, l-LFA huwa adattat tajjeb għall-iskoperta ta 'għajnejk, iwiegħed li jnaqqas il-konsum tal-kampjuni u jħaffef l-iskoperta.Paragun dettaljat tal-pjattaforma jidher fit-Tabella 2.
Analiżi diġitali jaqsmu l-kampjun f'ħafna mikroreatturi, li kull wieħed minnhom fih numru diskret ta 'molekuli fil-mira [139, 140].Assays diġitali joffru vantaġġi sinifikanti għat-twettiq ta 'kwantifikazzjoni assoluta billi jwettqu eluf ta' esperimenti bijokimiċi paralleli simultanjament u individwalment f'kompartimenti fuq skala mikron aktar milli f'fażi kontinwa.Meta mqabbla mal-mikrofluwidi tradizzjonali, ir-reazzjonijiet tal-kompartimenti jistgħu jnaqqsu l-volum tal-kampjun, iżidu l-effiċjenza tar-reazzjoni, u jiġu integrati faċilment ma 'metodi analitiċi oħra mingħajr il-ħtieġa ta' kanali, pompi, valvi, u disinji kompatti [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Iż-żewġ metodi li ġejjin jintużaw f'assaġġi diġitali biex tinkiseb separazzjoni uniformi u preċiża ta 'soluzzjonijiet, inklużi reaġenti u kampjuni bħal ċelluli, aċidi nuklejċi, u partiċelli jew molekuli oħra: (1) qatra emulsjonijiet li jisfruttaw instabbiltà tal-interface tal-likwidu;(2) id-diviżjoni tal-firxa titwettaq mir-restrizzjonijiet ġeometriċi tal-apparat.Fl-ewwel metodu, qtar li jkun fihom reaġenti u kampjuni f'mikrokanali jistgħu jinħolqu b'metodi passivi bħal ko-kurrent, crossflow, iffokar tal-fluss, emulsifikazzjoni fi stadji, emulsifikazzjoni ta 'mikrokanal, u membrani permezz ta' forzi ta 'shear viskuż u emulsifikazzjoni b'bidla fil-kanal.lokalizzazzjoni [143, 145, 146, 148, 149] jew bl-użu ta 'metodi attivi [150, 151], li jintroduċu enerġija addizzjonali permezz ta' kontroll elettriku, manjetiku, termali u mekkaniku.Fl-aħħar approċċ, l-aħjar uniformità tal-volum tal-fluwidu fil-kmamar mikrofluwidi hija kondiviża billi jinżammu strutturi spazjali tal-istess daqs, bħal micropits u arrays tal-wiċċ [152,153,154].Notevolment, il-qtar huma sezzjonijiet ewlenin tal-fluss li jistgħu wkoll jiġu ġġenerati u manipulati fuq arrays ta 'elettrodi bbażati fuq mikrofluwidi diġitali (DMF).L-elettrowetting tad-dielettriċi huwa wieħed mit-teoriji DMF l-aħjar studjati, peress li l-elettrowetting tad-dielettriċi jippermetti manipulazzjoni preċiża ta 'qtar individwali, li jikkontrolla l-forma tal-likwidu u sinjali elettriċi asimmetriċi li jgħaddu minn naħat differenti [141, 144].L-operazzjonijiet ewlenin bi qtar f'DMF jinkludu għażla, qsim, u amalgamazzjoni [151, 155, 156], li jistgħu jiġu applikati f'diversi oqsma ta 'analiżi, speċjalment fl-iskoperta molekulari [157, 158, 159].
L-iskoperta ta 'aċidu nuklejku diġitali hija teknoloġija dijanjostika molekulari tat-tielet ġenerazzjoni wara PCR konvenzjonali u PCR kwantitattiv f'ħin reali (qPCR), b'mod parallel ma' sekwenzar ta 'fluss għoli u bijopsija likwida.Fl-aħħar żewġ deċennji, l-aċidi nuklejċi diġitali żviluppaw malajr fil-qasam tad-dijanjostika molekulari ta 'patoġeni infettivi [160, 161, 162].Kwantifikazzjoni assoluta ta 'skoperta ta' aċidu nuklejku diġitali tibda bl-ippakkjar ta 'kampjuni u reaġenti f'kompartimenti individwali biex jiġi żgurat li kull sekwenza fil-mira jkollha l-istess probabbiltà li tidħol f'kull kompartiment individwali.Teoretikament, kull taqsima tista 'tiġi assenjata sekwenzi ta' mira multipli, jew jista 'ma jkunx hemm sistema ta' mikroreazzjoni indipendenti.Permezz tad-diversi mekkaniżmi sensing deskritti hawn fuq, kompartimenti b'sekwenzi ta' mira mikrobjali li jiġġeneraw sinjali 'l fuq minn ċertu limitu jistgħu jiġu viżwalizzati b'għajnejhom jew b'magna u huma ttikkettjati bħala pożittivi, filwaqt li kompartimenti oħra li jiġġeneraw sinjali taħt il-limitu huma ttikkettjati bħala pożittivi. .dawk negattivi, li jagħmlu s-sinjal għal kull taqsima boolean.Għalhekk, billi jiġi kkalkulat in-numru ta 'kompartimenti maħluqa u r-rata ta' riżultati pożittivi wara r-reazzjoni, il-kopji oriġinali tal-kampjuni tat-test jistgħu jiġu mqabbla bl-użu tal-formula tad-distribuzzjoni ta 'Poisson mingħajr il-ħtieġa ta' kurva standard, li hija meħtieġa għal analiżi kwantitattiva ta 'rutina bħal dawn bħala qPCR.[163] Meta mqabbel ma 'metodi dijanjostiċi molekulari tradizzjonali, l-iskoperta diġitali ta' l-aċidu nuklejku għandha grad ogħla ta 'awtomazzjoni, veloċità u sensittività ogħla ta' analiżi, inqas reaġenti, inqas kontaminazzjoni, u disinn u manifattura aktar sempliċi.Għal dawn ir-raġunijiet, l-użu ta 'assaġġi diġitali, speċjalment metodi bbażati fuq il-qatra, għal dijanjostika molekulari, li jgħaqqdu tekniki ta' amplifikazzjoni u qari tas-sinjali, ġie studjat sew waqt it-tifqigħa kritika tas-SARS-CoV-2.Per eżempju, Yin et al.[164] metodi kkombinati ta' qtar diġitali u PCR veloċi biex jiskopru l-ġeni ORF1ab, N, u RNase P f'SARS-CoV-2 f'ċippa mikrofluwidika.Notevolment, is-sistema setgħet tidentifika sinjal pożittiv fi żmien 115 sekonda, li huwa aktar mgħaġġel minn PCR konvenzjonali, li jindika l-effettività tagħha fl-iskoperta tal-punt tal-kura (Figura 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] u Alteri et al.[167] applika wkoll droplet digital PCR (ddPCR) biex tiskopri SARS-CoV-2 f'sistema mikrofluwidika b'riżultati impressjonanti.Biex tkompli ttejjeb ir-rata ta 'skoperta, Shen et al.[168] kisbet immaġini taċ-ċippa bbażata fuq ddPCR f'inqas minn 15 s mingħajr l-użu ta 'tekniki ta' ħjata tal-immaġni, u għaġġel il-proċess tat-teknoloġija ddPCR mil-laboratorju għall-applikazzjoni.Mhux biss jiġu applikati metodi ta 'amplifikazzjoni termali bħall-PCR, iżda wkoll metodi ta' amplifikazzjoni iżotermali jintużaw biex jissimplifikaw il-kundizzjonijiet ta 'reazzjoni u rispons mgħaġġel.Lu et al.[71] żviluppaw SlipChip għall-analiżi tal-qtar, li kapaċi jiġġenera qtar ta 'daqsijiet varji f'densitajiet għoljin fi stadju wieħed u jikkwantifika l-aċidi nuklejċi SARS-CoV-2 bl-użu ta' LAMP diġitali (Figura 7b).Bħala teknoloġija li qed tevolvi malajr, CRISPR jista’ wkoll ikollu rwol importanti fl-iskoperta diġitali tal-aċidu nuklejku permezz ta’ immaġni kolorimetrika konvenjenti mingħajr il-ħtieġa ta’ tbajja addizzjonali tal-aċidu nuklejku.Ackerman et al.żviluppat reazzjoni matriċi kombinatorja għall-evalwazzjoni multiplex ta 'aċidi nuklejċi.[158] skopra 169 vajrusis assoċjati mal-bniedem, inkluż SARS-CoV-2, fi qtar li fihom reaġenti ta 'skoperta ta' aċidu nuklejku bbażati fuq CRISPR-Cas13 f'assaġġ microwell (Figura 7c).Barra minn hekk, l-amplifikazzjoni iżotermika u t-teknoloġija CRISPR jistgħu jintużaw fl-istess sistema biex jgħaqqdu l-benefiċċji tat-tnejn.Park et al.[169] Ġie żviluppat analiżi diġitali CRISPR/Cas12a f'ċippa mikrofluwidika kummerċjali għall-iskoperta ta' SARS-CoV-2 estratt u maqtul bis-sħana bbażat fuq RT-RPA fi stadju wieħed b'detezzjoni sinjal għall-isfond iqsar u ogħla. proporzjon tal-ħin., firxa dinamika usa 'u sensittività aħjar (Fig. 7d).Xi deskrizzjonijiet ta’ dawn l-eżempji huma mogħtija fit-Tabella 3.
Pjattaforma diġitali tipika għall-iskoperta ta 'aċidu nuklejku.a Il-fluss tax-xogħol tal-PCR diġitali rapidu jikkonsisti f'erba' passi ewlenin: il-preparazzjoni tal-kampjun, id-distribuzzjoni tat-taħlita ta' reazzjoni, il-proċess ta' amplifikazzjoni, u l-kwantifikazzjoni tal-mira (adattat minn [164]).b Analiżi skematika li turi ta' qtar SlipChip għall-formazzjoni ta' qtar f'densità għolja (adattat minn [71]).c Dijagramma tal-fluss tax-xogħol CARMEN-Cas13 (adattat minn [158]).d Ħarsa ġenerali lejn is-sejbien avvanzat tal-virus diġitali b'CRISPR/Cas f'borma waħda (adattat minn [169]).W/O ilma fiż-żejt, polydimethylsiloxane PDMS, reazzjoni tal-katina tal-polimerażi PCR, ġbir tad-dejta DAQ, derivattiv integrali proporzjonali PID, reazzjoni matriċi kombinatorja CARMEN għall-evalwazzjoni tal-aċidu nuklejku multiplex, SARS-CoV-2, sindromu respiratorju akut sever, coronavirus 2 , RT Amplifikazzjoni tar-reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, sinjal S/B fl-isfond
Ħin tal-post: 15-Settembru 2022
